PK信號通路影響NSCLC細胞株中COX-2上調VEGF作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 近年研究證明，COX-2可通過上調前列腺素E2及其受體并激活蛋白激酶信號通路，上調腫瘤微環(huán)境中VEGF，從而對非小細胞肺癌的發(fā)展、腫瘤轉移及分子靶向治療耐藥的產生重要作用[1]。然而對于不同的非小細胞肺癌細胞株，COX-2具體通過PGE2下游的哪一條信號通路上調VEGF仍未成定論。
　　 本研究通過將COX-2、PKA選擇性抑制劑、PKC選擇性抑制劑及EP1/EP2選擇性抑制劑作用于各非小細胞肺癌細胞株

2、，觀察腫瘤細胞形態(tài)及VEGF表達量的變化，從而研究蛋白激酶信號通路在不同非小細胞肺癌細胞株中對COX-2上調VEGF作用的影響。
　　 研究目的：
　　 研究非小細胞肺癌細胞株，不同蛋白激酶(protein kinase，PK)信號通路對環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)上調血管內皮生長因子(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF)作用的影響。檢測COX-2

3、作用于各同非小細胞肺癌細胞株的EC50值。
　　 研究方法：
　　 1細胞培養(yǎng)
　　 A549細胞株用80％1640+20％胎牛血清培養(yǎng)，H460、A431及HBE用90％DMEM+10％胎牛血清培養(yǎng)，皆于5％CO2，37℃孵育。細胞貼壁長滿培養(yǎng)瓶后傳代，將細胞傳至4代后進行實驗。
　　 2檢測COX-2促進非小細胞肺癌細胞增殖的EC50值
　　 將培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞用無血清培養(yǎng)基沖洗3遍，以0.

4、25％胰酶消化3-5分鐘，使細胞間連接斷開呈單細胞懸液，以含血清培養(yǎng)基中和胰酶。將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100ul細胞懸液，使每孔細胞約8×103個(邊緣孔用無菌PBS填充)。5％CO2，37℃孵育12小時后，將COX-2原液稀釋為0-3000倍濃度梯度，分別加入96孔板中。5％CO2、37℃孵育24小時，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20ul5mg/ml MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)溶

5、液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，吸去孔內培養(yǎng)液。每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。同時設置空白對照組(培養(yǎng)基)，陰性對照組(細胞)。細胞生存力=藥物組平均吸光光度值/陰性對照組平均吸光光度值，由細胞生存力與藥物濃度在EXCEL中行線性回歸分析，得出EC50值。上述過程，每株細胞重復3次。
　　 3流式細胞技術定量檢測VEGF的表達
　　

6、 3.1證實在各非小細胞肺癌細胞株中，COX-2可促進VEGF上調
　　 將培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞用無血清培養(yǎng)基小心沖洗3遍，以0.25％胰酶消化3-5分鐘，使細胞間連接斷開呈單細胞懸液，以含血清培養(yǎng)基中和胰酶。將細胞接種于6孔板中，每孔加入1.5ml使每孔細胞約5×105個。5％CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底(約12-24小時)。血清饑餓12小時，從0-2倍EC50建立COX-2濃度梯度作用于各細胞株.設3個復孔，5％C

7、O2，37℃孵育12小時，以0.25％胰酶消化3-5分鐘，使細胞間連接斷開呈單細胞懸液，分孔收集細胞，分別用鼠抗人VEGF一抗及兔抗鼠二抗標記各組細胞表達的VEGF，并以流式細胞技術檢測各濃度梯度組VEGF的吸光率，分析吸光率的幾何平均數(shù)與COX-2濃度間的關系。
　　 3.2檢測COX-2、AH6809、KT5720、RO-31-8425作用于各非小細胞肺癌細胞株后VEGF表達量的變化
　　 將培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞用無血

8、清培養(yǎng)基小心沖洗3遍，以0.25％胰酶消化3-5分鐘，使細胞間連接斷開呈單細胞懸液，以含血清培養(yǎng)基中和胰酶。將細胞接種于6孔板中，每孔加入1.5ml使每孔細胞約5×105個。5％CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底(約12-24小時)。血清饑餓12小時，設置不加藥物細胞組、COX-2組、COX-2+AH6809組、COX-2+KT5720組、COX-2+RO-31-8425組、AH6809組、KT5720組、RO-31-8425組，在

9、COX-2組、COX-2+AH6809組、COX-2+KT5720組、COX-2+RO-31-8425組中先加入已測得濃度得COX-2，每組設置6個復孔，繼續(xù)5％CO2，37℃孵育12小時，分別在COX-2+AH6809組、COX-2+KT5720組、COX-2+RO-31-8425組、AH6809組、KT5720組、RO-31-8425組中加入所需抑制劑劑，繼續(xù)5％CO2，37℃孵育12小時，終止培養(yǎng)，以0.25％胰酶消化3-5分鐘，

10、使細胞間連接斷開呈單細胞懸液，分別用鼠抗人VEGF一抗及兔抗鼠二抗標記各組細胞表達的VEGF，并以流式細胞技術檢測各濃度梯度組VEGF的吸光率，上述過程，每株細胞重復3次。對各組細胞表達VEGF吸光率的幾何平均數(shù)進行T檢驗。
　　 4統(tǒng)計學處理
　　 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析。
　　 研究結果：
　　 1 COX-2作用于A549、H460及A4

11、31的EC50值(MTT法)COX-2作用于A549、H460及A431的EC50值分別是：8.95nmol/l，11.2nmol/l及8.44nmol/l。COX-2對HBE細胞的增長無明顯影響。
　　 2 COX-2在一定濃度范圍內，可促進非小細胞肺癌細胞株的增殖。
　　 3 PKC選擇性抑制劑可明顯抑制由COX-2引起的VEGF的上調；在大細胞肺癌細胞株中，EP2選擇性抑制劑對由COX-2引起的VEGF的上調有一定

12、的影響。
　　 在各非小細胞肺癌細胞株中，蛋白激酶C(PKC)選擇性抑制劑可明顯抑制由COX-2引起的VEGF的上調，而蛋白激酶A(PKA)選擇性抑制劑的此種抑制作用不明顯。在大細胞肺癌細胞中，EP2選擇性抑制劑對由COX-2引起的VEGF的上調有一定的影響。
　　 結論：
　　 在非小細胞肺癌細胞株中，由COX-2過表達引起的VEGF的上調與PKC激酶信號系統(tǒng)有關；對大細胞肺癌細胞株H460，由COX-2過表達