5-Aza-CdR聯(lián)合5-FU誘導人結(jié)腸癌細胞株Caco-2凋亡的影響.pdf

1、目的： （1）檢測四株人結(jié)腸癌細胞株中p16基因甲基化狀態(tài)。 （2）觀察p16基因甲基化的結(jié)腸癌細胞株Caco-2在去甲基化制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）處理前后對其生長抑制現(xiàn)象、對化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）敏感性以及5-FU誘導的細胞凋亡敏感性方面的變化，為結(jié)腸癌的發(fā)生機制和聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。 方法：采用MSP法檢測四株不同的人結(jié)腸癌細胞株中p16基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，應用不同濃

2、度（0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L以及5μmol/L）的5-Aza-CdR處理人結(jié)腸癌細胞株Caco-2，觀察處理前后p16基因mRNA表達水平的變化情況；采用四甲基偶氮唑鹽法（MTT法）檢測5-Aza-CdR及5-FU對細胞株Caco-2的生長抑制作用、RT-PCR及western-blotting檢測凋亡相關(guān)基因bax，bnip3，bcl-2的表達變化、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況的變化以及Giems

3、a染色普通光學顯微鏡及Hoechst33342染色熒光顯微鏡觀察去甲基化處理前后的細胞株在細胞形態(tài)學方面的改變。 結(jié)果： （1）采用MSP方法檢測四株結(jié)腸癌細胞株中p16基因的甲基化狀態(tài)，p16基因在Caco-2及RKO細胞株中啟動子區(qū)呈完全甲基化狀態(tài)；在SW480及HCT116中呈半甲基化狀態(tài)。 （2）采用四種不同濃度5-Aza-CdR（0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L以及5μm

4、ol/L）處理人結(jié)腸癌細胞株Caco-272h后，可檢測出p16mRNA表達。MSP結(jié)果顯示，經(jīng)1.25μmol/L、2.5μmol/L及5μmol/L5-Aza-CdR處理后同時檢測出甲基化及非甲基化引物擴增的產(chǎn)物。 （3）5-Aza-CdR及5-FU處理后的Caco-2細胞株生長速度均明顯慢于正常組（P<0.01）。 （4）5-Aza-CdR對5-FU誘導的Caco-2細胞的早期凋亡隨著時間延長而增加；5-Aza-C

5、dR聯(lián)合5-FU誘導Caco-2細胞凋亡的作用優(yōu)于兩者單純相加，具有協(xié)同作用（P<0.05）。 （5）5-Aza-CdR聯(lián)合5-FU處理組中Caco-2細胞株可觀察到細胞凋亡所特有的典型形態(tài)學特征。 （6）RT-PCR及western-blotting均顯示聯(lián)用藥組凋亡相關(guān)基因bax及bnip3表達顯著增強（P<0.01），bcl-2的表達明顯減弱（P<0.01）。 結(jié)論： （1）p16在人結(jié)腸癌細胞株C

6、aco-2中表達沉默，DNA甲基化是其表達沉默的機制之一，去甲基化制劑5-Aza-CdR可以逆轉(zhuǎn)并恢復基因的重新表達。 （2）5-Aza-CdR及5-FU對Caco-2細胞株生長速度均有較明顯的抑制作用。 （3）5-Aza-CdR聯(lián)合5-FU誘導Caco-2細胞凋亡的作用優(yōu)于兩者單純相加，具有協(xié)同作用。其中聯(lián)合用藥組可觀察到細胞凋亡所特有的典型形態(tài)學特征。 （4）5-FU誘導細胞凋亡具有時效性；5-Aza-CdR