人內(nèi)皮抑素小環(huán)載體的構建及其功能研究.pdf

1、研究背景及目的 非病毒載體不能在基因治療中被廣泛應用的一個主要原因是目的基因的短暫表達。Chen等的研究發(fā)現(xiàn)即使質粒DNA沒有丟失，也只能短暫表達轉基因產(chǎn)物。最新的研究表明，外源基因表達盒與細菌質粒骨架之間的共價連接會導致外源基因的沉默，這是造成質粒載體所攜帶的外源基因在體內(nèi)只能瞬時表達的主要原因，也是質粒載體臨床應用的主要限制因素。 小環(huán)DNA(minicircleDNA)載體是一種自1997年發(fā)展起來的新型的基因載體

2、，該載體所攜帶的外源基因的表達盒以環(huán)狀超螺旋的形式存在。與常用的非病毒載體——質粒載體相比，小環(huán)DNA載體僅由外源基因的表達盒構成，不含有來自細菌質粒的骨架結構，從而減少了未甲基化的CpG所致的炎性反應，提高了安全性；而堿基數(shù)的減小，更有效的提高了目的基因的表達和生物利用度。小環(huán)DNA載體克服了質粒載體轉染率低、易引起免疫反應及外源基因在體內(nèi)表達時間短的缺點，是一種安全、高效的新型載體。 最初的小環(huán)載體需經(jīng)體外酶切線性化細菌骨架

3、、氯化銫密度梯度離心以獲得純化的小環(huán)DNA。小環(huán)純化方法的復雜性增加了大規(guī)模制備的困難，限制了其在臨床上的應用。Chen等在2003年構建的小環(huán)載體系統(tǒng)采用源于鏈霉菌溫和噬菌體的φc31整合酶，并在母體質粒上插入內(nèi)切酶I-SceI的表達盒。φc31整合酶在宿主菌內(nèi)完成重組過程后，誘導I-SceI的表達，可將環(huán)狀骨架及少量未重組的母體質粒消化成為線性DNA，繼而在細菌核酸外切酶的作用下降解，小環(huán)DNA可以從細菌中一步獲得，毋需進一步純化，

4、產(chǎn)率高，有利于大規(guī)模制備。 Folkman等提出腫瘤的生長是血管依賴性的，因此抑制腫瘤血管的生長是治療腫瘤的一個有效策略。內(nèi)皮細胞抑制素(endostatin，ES)，是1997年0’Reilly和Folkman在患血管內(nèi)皮瘤的小鼠血清中分離得到的一種血管生成抑制因子，分子量為20kDa，由膠原蛋白ⅩⅧ的C-末端膠原區(qū)內(nèi)的184個氨基酸片段構成，能特異性抑制血管內(nèi)皮細胞的生長，而不影響其它非內(nèi)皮系統(tǒng)起源的細胞。在內(nèi)源性血管生成抑

5、制劑中，內(nèi)皮抑素有最廣泛的抗腫瘤譜，它所靶向的血管生成調節(jié)基因占基因組的12％。內(nèi)皮細胞抑制素通過上調與血管生成抑制相關的基因，下調與血管生成促進相關的基因而對血管生成的多條信號通路進行調節(jié)。 目前有關小環(huán)DNA的研究僅限于構建和純化方法的研究，尚無攜帶內(nèi)皮抑素治療腫瘤的報道。本實驗旨在采用含有φc31整合酶的質粒pφC31，構建表達人內(nèi)皮抑素的小環(huán)DNA載體，并與普通質粒在體外培養(yǎng)真核細胞和動物模型中的表達效率和表達時間進行比

6、較；并觀察其對裸鼠鼻咽癌移植瘤的抑制作用。 方法從pcDNA3.1(+)中分別擴增Pcmv和BGHpolyA片段，定向克隆于pSP72中，構建成pSP72-Pcmv-BGHpolyA。將從pSP72-hEndostatin-IRES-EGFP中酶切得到的hEndostatin-IRES-EGFP克隆到pSP72-Pcmv-BGHpolyA，構建成pSP72-Pcmv-hEndostatin-IRES-EGFP-BGHpolyA(

7、pSP72-hES)。將pSP72-hES中的整個表達框亞克隆至pφC31構建母環(huán)質粒pφ-hES。pφ-hES在含阿拉伯糖的LB培養(yǎng)液中，32℃誘導φC31整合酶介導的分子內(nèi)重組，產(chǎn)生一個只含目的基因表達盒的小環(huán)和一個含有細菌骨架的小質粒。繼而在37℃激活I-SceI酶降解閉環(huán)的細菌骨架后，抽提獲取小環(huán)mc-hES。 將hEndostatin-IRES-EGFP片段亞克隆至pcDNA3.1載體構建endostatin的普通真核

8、表達質粒pcDNA-hES作為研究的對照。 將mc-hES、pφ-hES、pcDNA-hES分別轉染CNE2細胞48小時后，通過RT-PCR和Westernblot觀察其表達。MTT法檢測endostatin對HUVEC的增殖抑制作用。建立CNE2裸鼠移植瘤模型，觀察mc-hES和pcDNA-hES的抑瘤活性。通過RT-PCR檢測mc-hES介導轉基因在體內(nèi)的長期表達。免疫組化檢測內(nèi)皮抑素在腫瘤組織中的表達。 結果經(jīng)DN

9、A測序表明構建的pφ-hES、mc-hES、pcDNA-hES序列正確，轉染CNE2細胞后，均有EGFP和人內(nèi)皮抑素蛋白的表達。在相同情況下，小環(huán)DNA載體的轉染效率和目的基因表達強度均優(yōu)于傳統(tǒng)的質粒載體。MTT顯示endostatin抑制HUVEC的增殖，而對CNE2無作用。體內(nèi)實驗顯示：小環(huán)組腫瘤體積明顯小于空質粒對照組和pcDNA-hES組。mc-hES組較pcDNA-hES組能明顯抑制腫瘤的生長(P＜0.05)。RT-PCR結果

10、顯示小環(huán)組在體內(nèi)可以表達內(nèi)皮抑素蛋白20天以上，而pcDNA-hES對照組則在第7天時就已經(jīng)很弱，在第14天時就檢測不到內(nèi)皮抑素的表達。mc-hES、pcDNA-hES、空質粒組抑瘤率分別為46.42％、15.8％、1.8％，小環(huán)組較pcDNA-hES組有顯著性差異，生理鹽水組和空載體組無顯著性差異。 結論1成功構建了真核表達載體pφ-hES、mc-hES、pcDNA-hES，轉染真核細胞后在mRNA和蛋白水平證實有hEndos

11、tatin和EGFP的表達，且在相同情況下，小環(huán)組明顯高于其他兩組。 2內(nèi)皮抑素能特異抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，而對鼻咽癌細胞無抑制作用。內(nèi)皮抑素對腫瘤的抑制作用是通過抑制腫瘤血管的形成而起作用的。 3mc-hES在一次給藥后，較pcDNA-hES能明顯抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生長，長期高效表達內(nèi)皮抑素蛋白，達20天之久，明顯長于普通質粒。 4小環(huán)較普通質粒更能長期、高效的介導轉基因的表達，是一種較為理想的基因治療的