人與鼠源內(nèi)皮抑素基因合成和原核表達(dá)及功能驗(yàn)證.pdf

1、目的:血管內(nèi)皮抑素最初是從小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)基中分離純化而來(lái)，一種內(nèi)源性血管生成抑制劑，是膠原蛋白18C末端的一個(gè)片段，能特異性地抑制新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖從而抑制血管的增生，內(nèi)皮抑素不影響已生成成熟血管的功能，因此是一種理想的新生血管生成抑制劑，在臨床上用于抑制腫瘤血管生成從而達(dá)到腫瘤治療目的，重組內(nèi)皮抑素主要通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得，其中絕大部分是以包涵體形式存在。人與鼠源內(nèi)皮抑素基因具有高度的同源性和相似的生物學(xué)功能。

2、本文將確定人與鼠源內(nèi)皮抑素基因并構(gòu)建不同表達(dá)標(biāo)簽的原核表達(dá)載體探討內(nèi)皮抑素的可溶性表達(dá)以及驗(yàn)證重組人源內(nèi)皮抑素對(duì)新生血管的抑制作用。
　　方法:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)確定Human Endostatin(HE)和Mouse Endostatin(ME) DNA序列，DNA合成法分別獲得人與鼠源內(nèi)皮抑素基因，加入不同酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后膠回收，分別與攜帶谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)表達(dá)標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-

3、4T1和攜帶硫氧還蛋白A(TrxA)表達(dá)標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a進(jìn)行雙酶切處理、T4DNA連接酶連接，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1-HE和pET-32a-ME，將兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，確定人與鼠源內(nèi)皮抑素的誘導(dǎo)表達(dá)條件，將誘導(dǎo)后的菌液超聲破碎，離心后上清和沉淀分別進(jìn)行蛋白電泳確定蛋白分布，將內(nèi)皮抑素包涵體洗滌、變性、復(fù)性、濃縮后獲得重組蛋白，最后通過雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證人源重組內(nèi)

4、皮抑素蛋白的抗血管生成活性。
　　結(jié)果:測(cè)序分析表明成功合成人與鼠源內(nèi)皮抑素基因，通過PCR擴(kuò)增確定人與鼠源內(nèi)皮抑素基因大小為560bp左右，與理論符合，通過分子克隆分別將人與鼠源內(nèi)皮抑素基因連接進(jìn)入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1和pET-32a，經(jīng)PCR、雙酶切、測(cè)序分析顯示原核表達(dá)載體pGEX-4T1-HE和pET-32a-ME構(gòu)建成功，在37℃，1 mmol/L IPTG濃度下，大腸桿菌BL21(DE3)中人、鼠源內(nèi)皮抑素成功

5、表達(dá)，通過SDS-PAGE分析，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)目的條帶，其中人源內(nèi)皮抑素重組蛋白在46 kDa處出現(xiàn)，鼠源內(nèi)皮抑素重組蛋白在39 kDa處出現(xiàn)，與理論相符，人與鼠源內(nèi)皮抑素主要以包涵體形式表達(dá)，在破碎后的菌體上清中沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素的分布，通過對(duì)包涵體的洗滌、純化、復(fù)性獲得人與鼠源重組內(nèi)皮抑素蛋白，在雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的血管數(shù)少，血管管徑細(xì)。
　　結(jié)論:研究結(jié)果表明獲得了長(zhǎng)度為554 bp的人源內(nèi)皮