分泌表達人血管抑素K（1-3）、內(nèi)皮抑素基因工程細胞的構(gòu)建.pdf

1、分泌表達人血管抑素K(1-3)、內(nèi)皮抑素的基因工程細胞的構(gòu)建目的：利用分子生物學和細胞學技術(shù)構(gòu)建篩選出兩種分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人血管抑素K(1-3)、內(nèi)皮抑素基因并能分泌表達人血管抑素K(1-3)、內(nèi)皮抑素蛋白的重組C2C12細胞，為利用移植微囊化基因工程細胞技術(shù)將人血管抑素K(1-3)、內(nèi)皮抑素基因?qū)塍w內(nèi)，進行腫瘤治療研究奠定基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)文獻報道的序列設(shè)計引物，利用RT-PCR從人胎肝細胞提取的RNA中擴增人血管抑素K(1-3

2、)、內(nèi)皮抑素基因，利用重疊延伸PCR技術(shù)將人白細胞介素-2信號肽的DNA編碼序列融合到內(nèi)皮抑素基因的5'端，T-A克隆到pGEM-T載體中，測序正確后定向亞克隆到真核表達載體pcDNA3中，構(gòu)建出真核表達載體pcDNA3-ASK(1-3)、pcDNA3-SS-ES。利用脂質(zhì)體將測序的重組載體轉(zhuǎn)染C2C12細胞，利用G418篩選，進行單克隆培養(yǎng)。從獲得的單克隆利用RT-PCR和westernblot篩選出分泌表達目的蛋白的重組細胞克隆。

3、 結(jié)果：利用RT-PCR從人胎肝細胞RNA得到的人血管抑素K(1-3)、內(nèi)皮抑素基因在10g/L的瓊脂糖凝膠電泳上分別顯示為約1100bp和550bp的條帶，與預(yù)期大小一致。測序結(jié)果中，血管抑素(K1-3)基因中有兩處堿基突變，但均屬于同義突變。內(nèi)皮抑素基因序列與GENEBANK中提供的序列一致且其5'端與人白細胞介素-2信號肽DNA編碼序列成功融合。將pcDNA3-ASK(1-3)、pcDNA3-SS-ES轉(zhuǎn)染C2C12細胞后利

4、用1000μg/ml的G418篩選后有抗性細胞單克隆形成。各挑選八單克隆提取RNA利用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)各有兩個克隆有目的基因轉(zhuǎn)錄。RT-PCR檢測出有人血管抑素(K1-3)、內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)錄的重組C2C12細胞克隆的培養(yǎng)基上清westernblot檢測分別可見46kD、20kD的特異蛋白條帶，與文獻報道一致。結(jié)論：成功利用RT-PCR技術(shù)人胎肝細胞RNA中克隆了人血管抑素K(1-3)、內(nèi)皮抑素基因；成功利用重疊延伸PCR技術(shù)在內(nèi)皮抑