攜帶人內(nèi)皮抑素基因腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及相關(guān)功能的研究.pdf

1、研究背景 子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，簡稱內(nèi)異癥或EMs)是一種雌激素依賴性疾病，其真正的病因和發(fā)病機制還不明確。目前臨床上治療的主要目標只局限于減輕疼痛，提高妊娠率以及盡可能的延遲疾病復(fù)發(fā)，尚不存在針對病因治療的藥物，疾病也無法得到根治。腹腔鏡手術(shù)治療內(nèi)異癥，是目前外科治療的方法之一，但在輕中度病變、不孕和復(fù)發(fā)患者中手術(shù)的價值還存在爭議。在內(nèi)異癥發(fā)病機制的研究中，目前普遍接受的觀點是1927年Sampson等提

2、出的“種植學(xué)說”，指出異位灶必須在新生血管的支持下才能維持內(nèi)膜的生存和發(fā)展。血管生成機制已成為內(nèi)異癥公認的重要發(fā)病機制之一。 內(nèi)皮抑素(Endostatin)是目前已知最強的內(nèi)源性血管形成抑制因子，它能特異地抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，這預(yù)示著其在內(nèi)異癥治療中具有的巨大潛力。 目前對于內(nèi)皮抑素用于抗腫瘤血管生成的研究備受關(guān)注，且其蛋白治療在國外已進入到Ⅱ期臨床試驗階段，但由于內(nèi)皮抑素蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，半衰期短，需多次重復(fù)給藥，

3、且其生產(chǎn)工藝復(fù)雜，這些都大大限制了其應(yīng)用。如果能采取基因治療的策略，使機體本身變成一個生產(chǎn)內(nèi)皮抑素蛋白的“工廠”，就可能徹底解決上述問題。腺病毒載體的應(yīng)用為內(nèi)皮抑素實現(xiàn)基因治療提供了一個很好的途徑，被廣泛地應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種疫苗和基因治療等各個領(lǐng)域。 目的 為深入研究內(nèi)皮抑素在子宮內(nèi)膜異位癥治療中的療效，我們擬構(gòu)建包含人內(nèi)皮抑素(hEndostatin)基因的缺陷型腺病毒質(zhì)粒，利用相應(yīng)的包裝細胞系，制備具有感染

4、能力的腺病毒顆粒，去感染與血管生成密切相關(guān)的血管內(nèi)皮細胞，觀察對內(nèi)皮細胞的影響，驗證并探討其功能和作用機制，為進一步研究內(nèi)皮抑素在子宮內(nèi)膜異位癥動物模型上的治療作用打下基礎(chǔ)。 方法與結(jié)果 1．用基因工程方法獲得人內(nèi)皮抑素基因，設(shè)計特定限制性酶切位點，將內(nèi)皮抑素基因插入缺陷型腺病毒載體中。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證，所獲得目的基因序列與已發(fā)表的人內(nèi)皮抑素基因序列相比，第471位氨基酸編碼堿基由G突變?yōu)锳，但編碼的氨基酸都是精

5、氨酸，與GenBank中人內(nèi)皮抑素蛋白質(zhì)序列完全一致，屬于沉默突變型，不影響后續(xù)表達。 2．將重組腺病毒質(zhì)粒線性化后通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，得到包含人內(nèi)皮抑素基因的完整腺病毒顆粒，通過氯化銫密度梯度離心法加以純化后，用OD260法測定其病毒滴度為5.2×10<'9>pFU/mL。 3．利用構(gòu)建好的重組人內(nèi)皮抑素腺病毒Ad-hEndo感染ECV-304臍靜脈內(nèi)皮細胞，western

6、blot測定hEndostatin蛋白的表達情況，流式細胞術(shù)檢測Ad-hEndo引起ECV-304細胞凋亡的情況，繪制Ad-hEndo感染后的ECV-304細胞生長曲線。與對照組相比，病毒感染48小時后檢測到明顯的hEndostatin蛋白表達，流式細胞術(shù)證實Ad-hEndo在感染3d后出現(xiàn)ECV-304細胞凋亡，細胞生長曲線監(jiān)測顯示ECV-304細胞在Ad-hEndo感染后生長受到明顯限制。 結(jié)論 通過構(gòu)建包含人內(nèi)皮抑