rAAV載體介導(dǎo)內(nèi)皮抑素抑制鼻咽癌生長和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景鼻咽癌是我國南方及新加坡、馬來西亞等東南亞地區(qū)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，目前強(qiáng)調(diào)以放療為首選的綜合治療方法，其5年平均生存率均低于50％，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌患者主要死亡原因。鼻咽癌同其他實(shí)體瘤一樣，其生長是血管依賴性的，需要新生血管為其提供養(yǎng)料和氧氣。大量研究也表明，新生血管的形成對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，以腫瘤間質(zhì)中的血管為靶點(diǎn)，通過抑制腫瘤新生血管的形成，達(dá)到“餓死”腫瘤的抗血管生成療法已日益成為治療腫

2、瘤的研究熱點(diǎn)和新策略。腫瘤的新生血管形成是一個多因子參與的多步驟過程，主要受一系列的正性及負(fù)性調(diào)控因子相互制約調(diào)節(jié)。正性調(diào)控因子主要包括血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子等。負(fù)性調(diào)控因子包括血小板反應(yīng)素、干擾素、血小板因子4、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、血管抑素及內(nèi)皮抑素等。其中內(nèi)皮抑素以其強(qiáng)烈的抗血管生成效果而引起科學(xué)家的極大關(guān)注。 內(nèi)皮抑素是1997年O'Reilly等從培養(yǎng)的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞瘤(EOMA)上清中分離純化的一種內(nèi)

3、源性血管生成抑制劑，分子量為20KD，是膠原18降解產(chǎn)物的C末端片斷。研究表明：在體外，內(nèi)皮抑素能特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡。同時大量的動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)：內(nèi)皮抑素能顯著地抑制腫瘤新生血管形成，抑制多種實(shí)體瘤的生長和轉(zhuǎn)移，甚至使腫瘤縮小到休眠狀態(tài)。內(nèi)皮抑素可能成為最有前途的腫瘤抗血管生成抑制劑，在美國已進(jìn)入Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)。 目前，大部分研究者是使用重組純化的蛋白形式內(nèi)皮抑素進(jìn)行腫瘤抗血管生成治療實(shí)驗(yàn)，在美國用于

4、臨床試驗(yàn)的內(nèi)皮抑素就是畢赤酵母基因工程表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物。但是重組內(nèi)皮抑素蛋白生產(chǎn)、純化工藝復(fù)雜，且蛋白形式的內(nèi)皮抑素在體內(nèi)半衰期短，需長期給藥，使用藥量大，費(fèi)用高。這些都將限制內(nèi)皮抑素的進(jìn)一步應(yīng)用。通過基因治療，把內(nèi)皮抑素基因?qū)塍w內(nèi)，使機(jī)體內(nèi)長期、穩(wěn)定地表達(dá)有生物活性的內(nèi)皮抑素蛋白，不僅可解決這一系列問題，而且能達(dá)到同樣效果，因此基因治療可能成為一種有希望的治療策略。。 基因治療的關(guān)鍵是轉(zhuǎn)基因載體，即如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體使目的

5、基因在機(jī)體內(nèi)獲得安全、有效、穩(wěn)定的表達(dá)。相對其他病毒載體，重組腺腺相關(guān)病毒是一種安全、有效的病毒載體，具有以下優(yōu)點(diǎn)：病毒DNA能穩(wěn)定、定點(diǎn)整合在人19號染色體上，從而避免了隨機(jī)整合而導(dǎo)致宿主細(xì)胞突變的潛在危險；能感染分裂期和非分裂期細(xì)胞；去除了病毒所有開放閱讀框架(ORF)，僅保留病毒包裝、復(fù)制、轉(zhuǎn)染所必須的兩個倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列(ITR)，減少引起宿主免疫反應(yīng)概率，因而能實(shí)現(xiàn)目的基因的長期穩(wěn)定表達(dá)。成為目前最有前途的基因治療載體。

6、 基于以上研究背景，本研究將重組腺相關(guān)病毒技術(shù)和內(nèi)皮抑素基因治療技術(shù)結(jié)合起來，探討內(nèi)皮抑素抗血管生成治療在鼻咽癌裸鼠動物模型中的效果。本課題為廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：04020406)。本實(shí)驗(yàn)所用的分別攜帶人內(nèi)皮抑素或增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-hEndo及rAAV-EGFP由香港大學(xué)分子生物研究所彭英教授惠贈。 目的和意義利用重組腺相關(guān)病毒為載體，介導(dǎo)人內(nèi)皮抑素的表達(dá)，檢測其體外

7、感染效率。通過系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，鑒定轉(zhuǎn)染后目的蛋白的表達(dá)并檢測其體外生物活性。通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)，探討重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素在裸鼠鼻咽癌異位移植瘤生長和轉(zhuǎn)移中的抑制作用，不僅能為探討鼻咽癌內(nèi)皮抑素基因治療的可行性提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，而且能為鼻咽癌治療開辟一條安全、有效的腫瘤抗血管生成治療新途徑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法本實(shí)驗(yàn)分為二部分，第一部分：體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，首先通過體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測rAAV的體外感染效率及最佳感染復(fù)數(shù)；免疫熒光染色鑒定

8、rAAV-hEndo體外轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮抑素蛋白的表達(dá)。然后通過3個細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察內(nèi)皮抑素的體外生物活性：MTT實(shí)驗(yàn)檢測rAAV-hEndo感染細(xì)胞培養(yǎng)上清對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304增殖的抑制作用；流式細(xì)胞檢測rAAV-hEndo感染ECV304細(xì)胞后細(xì)胞周期分布情況，觀察內(nèi)皮抑素對血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期的影響；原位末端標(biāo)記TUNEL法檢測ECV304感染rAAV-hEndo后的細(xì)胞調(diào)亡指數(shù)，觀察內(nèi)皮抑素誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的調(diào)亡

9、作用。 第二部分：體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)，首先利用鼻咽癌細(xì)胞株C666-1裸鼠肝包膜下注射，建立裸鼠鼻咽癌肝臟異位移植瘤動物模型；再經(jīng)尾靜脈分別注射rAAV-hEndo、rAAV-EGFP或PBS，3周后斷髓處死裸鼠，觀察動物肝臟成瘤、肺轉(zhuǎn)移及腹水等情況，測量腫瘤體積大小，計算抑瘤率，同時各另設(shè)1組用于觀察生存期。常規(guī)病理檢測肝臟腫瘤生長及肺轉(zhuǎn)移情況，二步法免疫組化檢測肝臟組織中內(nèi)皮抑素蛋白的表達(dá)及腫瘤微血管密度(MVD)，原位末端標(biāo)記T

10、UNEL法檢測腫瘤細(xì)胞調(diào)亡指數(shù)(AI)。最后利用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，整理數(shù)據(jù)，分析結(jié)果。 結(jié)果體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明rAAV感染復(fù)數(shù)MOI為5×104時感染效率最高，達(dá)98％。免疫熒光染色顯示rAAV-hEndo體外轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞48h后，能有效表達(dá)目的基因蛋白，內(nèi)皮抑素蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿，呈強(qiáng)熒光染色，而細(xì)胞核呈弱熒光染色。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：rAAV-hEndo感染細(xì)胞培養(yǎng)上清能顯著抑制ECV304細(xì)胞的增殖，72

11、h增殖抑制率為67.3％。流式細(xì)胞分析顯示：內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染rAAV-hEndo48h后，細(xì)胞周期明顯阻滯于G1期，其G1期占(72.5±4.0)％，與對照組(52.1±2.1)％比較，差異有非常顯著意義(P＜0.01)。TUNEL法檢測實(shí)驗(yàn)組內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡指數(shù)為(32.6±3.2)％，與對照組(4.2±1.9)％比較，差異有非常顯著意義(P＜0.01)。 動物實(shí)驗(yàn)表明：hEndo組經(jīng)尾靜脈注射rAAV-hEndo3周后，肝臟腫瘤體積

12、為(0.4809±0.2069)cm3，明顯小于EGFP組(1.3109±0.4368)cm3和PBS組(1.6442±0.5379)cm3，相對PBS組，hEndo組抑瘤率為70.7％。HE染色顯示EGFP組和PBS組肝臟腫瘤細(xì)胞生長旺盛，壞死區(qū)少見，肺部可見腫瘤轉(zhuǎn)移灶，肺轉(zhuǎn)移率分別為50.0％、66.7％；而hEndo組肝臟腫瘤組織可見大量壞死灶，且無一例出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，提示內(nèi)皮抑素完全抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。微血管密度檢測顯示：hEndo組

13、MVD為(3.67±1.63)，明顯低于EGFP組(19.67±2.16)和PBS組(22.50±3.02)，經(jīng)單因素方差檢驗(yàn)，差異有非常顯著意義(P＜0.01)。TUNEL法檢測顯示：hEndo組調(diào)亡率為(28.83±5.27)％，而EGFP組和PBS組各為(6.17±2.79)％、(4.50±2.17)％。經(jīng)單因素方差檢驗(yàn)，差異有非常顯著意義(P＜0.01)。證實(shí)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后能有效抑制腫瘤新生血管形成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡。hEn

14、do組平均生存期為(36.50±8.46)d，EGFP組為(24.00±5.66)d，PBS組為(21.17±3.92)d。經(jīng)log-rank時序檢驗(yàn)，hEndo組動物生存期比EGFP組和PBS組顯著延長(P＜0.01)。 結(jié)論細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)所采用的重組腺相關(guān)病毒感染效率高，轉(zhuǎn)染后能有效表達(dá)目的基因蛋白。所表達(dá)的內(nèi)皮抑素蛋白具有有效的生物活性，能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的增殖，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，并誘導(dǎo)內(nèi)皮