Si-RNA和過表達慢病毒載體轉染大鼠肝星狀細胞SUMo-1表達的影響.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一組非常常見的慢性肝疾病的病理學綜合征。在整個肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，肝細胞內會發(fā)現許多基因的發(fā)生異常表達，并增加發(fā)展為肝細胞性癌的危險性。在肝纖維化的發(fā)生過程中，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化增殖是其中的一個重要環(huán)節(jié)。肝星狀細胞位于竇周Disse間隙內，在正常狀態(tài)下，HSC主要儲存和代謝維生素A，合成與分泌少量的細胞外基質（extrace

2、llular matrix，ECM）。當HSC受刺激過度激活時，轉變成具有增生活性的、產生纖維的具收縮特性的肌成纖維細胞并表達α平滑肌肌動蛋白(Alpha smooth muscle actin，α-SMA)合成異常增多的ECM超過肝清除能力導致其在肝內聚集是肝纖維化形成的重要機制。有研究表明適當濃度的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可刺激HSC，使其提高增殖率和表達細胞內膠原增強。LPS誘導的細胞模型能夠較好地模

3、擬出肝纖維化形成過程中HSC在數量和功能方面的主要改變，為HSC活化的研究提供了一個較為全面的細胞模型。
　　小泛素相關修飾物（small ubiquitin-like modifier, SUMO）基因家族有四個家庭成員，其通過共價連接修飾靶蛋白，并參與蛋白質間的相互作用，調控細胞內靶蛋白分布及其功能。我們研究發(fā)現隨著肝纖維化程度的加深，SUMO-1的表達增強。SUMO-1可能通過大量增強TGF-β1以及PDGF的表達，進而促進

4、HSC的增殖和活化，促進其分泌大量膠原，并減少膠原降解而導致大量膠原異常沉積，表現出的作用是促進肝纖維化。SUMO-1可可以修飾其他生長因子，維持相關蛋白質的穩(wěn)定性，從而調控肝纖維化甚至的肝癌的發(fā)展過程。因此，我們設計該實驗進一步研究SUMOs在肝纖維化過程中的作用及其機制，為肝纖維化的治療提供新的思路。本實驗首先利用Western blot及定量PCR檢測LPS刺激HSC-T6模擬肝纖維化的過程中SUMO-1表達水平的變化，進一步了解

5、SUMO-1在肝纖維化中的作用。然后我們通過針對SUMO-1慢病毒轉染LPS激活后的HSC-T6，利用Western blot及定量PCR證實SUMO-1的表達水平的確得到干擾及上調，再利用流式細胞儀檢測轉染后各組細胞株的細胞周期及凋亡，以期闡明SUMO-1在肝纖維化中的作用機制。
　　第一部分不同濃度LPS刺激HSC-T6 SUMO-1的表達水平變化
　　目的:
　　探討能模擬肝纖維化時LPS刺激大鼠肝星狀細胞的最佳

6、濃度
　　方法:
　　分別用終濃度為0，1ug/ml，10ug/ml，100ug/ml，200ug/ml的LPS刺激HSC-T624小時后分別提取RNA及蛋白質，后利用定量PCR及western blotting檢測SUMO-1的表達水平及利用western blotting檢測α-SMA的表達水平。
　　結果:
　　定量PCR發(fā)現濃度為的10ug/ml LPS刺激HSC-T6其SUMO-1的表達水平最高，各組差

7、異具有統計學意義(P＜0.05)。Western blot驗證SUMO-1上述規(guī)律并且與α-SMA的表達規(guī)律一致，各組差異具有統計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　LPS能夠有效激活HSC-T6，在濃度為的10ug/mlLPS可最好模擬肝纖維化，與SMUO-1的表達規(guī)律一致。結果說明SMUO-1可能在LPS激活HSC-T6過程中取到一定作用。
　　第二部分SUMO-1表達變化后對HSC-T6增殖的影響及其機制研

8、究
　　目的:
　　初步探索SUMOs在HSC-T6激活過程中的作用及其機制
　　方法:
　　將人工合成的針對SUMO-1基因的siRNA慢病毒及SUMO-1過表達慢病毒載體轉染HSC-T6，采用定量PCR和Western blot方法檢測轉染后HSC-T6中SUMO-1的表達變化，并利用流式細胞儀檢測HSC-T6的周期及凋亡。后用Realtime PCR檢測SUMO-2及SUMO-3的表達水平。
　　結果

9、:
　　人工合成的針對SUMO-1基因的siRNA慢病毒能抑制肝星狀細胞中SUMO-1基因的表達但SUMO-2及SUMO-3的表達上調，而SUMO-1過表達慢病毒載體轉染肝星狀細胞后SUMO-1表達增強但SUMO-2及SUMO-3的表達水平下調，與對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。轉染后HSC-T6的周期及凋亡，各組差異無統計學意義(P＞0.05)。
　　結論:
　　SUMO-1 siRNA沉默肝星狀細胞中S