Si-RNA和過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞SUMo-1表達(dá)的影響.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一組非常常見的慢性肝疾病的病理學(xué)綜合征。在整個肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，肝細(xì)胞內(nèi)會發(fā)現(xiàn)許多基因的發(fā)生異常表達(dá)，并增加發(fā)展為肝細(xì)胞性癌的危險性。在肝纖維化的發(fā)生過程中，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化增殖是其中的一個重要環(huán)節(jié)。肝星狀細(xì)胞位于竇周Disse間隙內(nèi)，在正常狀態(tài)下，HSC主要儲存和代謝維生素A，合成與分泌少量的細(xì)胞外基質(zhì)（extrace

2、llular matrix，ECM）。當(dāng)HSC受刺激過度激活時，轉(zhuǎn)變成具有增生活性的、產(chǎn)生纖維的具收縮特性的肌成纖維細(xì)胞并表達(dá)α平滑肌肌動蛋白(Alpha smooth muscle actin，α-SMA)合成異常增多的ECM超過肝清除能力導(dǎo)致其在肝內(nèi)聚集是肝纖維化形成的重要機(jī)制。有研究表明適當(dāng)濃度的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可刺激HSC，使其提高增殖率和表達(dá)細(xì)胞內(nèi)膠原增強(qiáng)。LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞模型能夠較好地模

3、擬出肝纖維化形成過程中HSC在數(shù)量和功能方面的主要改變，為HSC活化的研究提供了一個較為全面的細(xì)胞模型。
　　小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-like modifier, SUMO）基因家族有四個家庭成員，其通過共價連接修飾靶蛋白，并參與蛋白質(zhì)間的相互作用，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)靶蛋白分布及其功能。我們研究發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化程度的加深，SUMO-1的表達(dá)增強(qiáng)。SUMO-1可能通過大量增強(qiáng)TGF-β1以及PDGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)

4、HSC的增殖和活化，促進(jìn)其分泌大量膠原，并減少膠原降解而導(dǎo)致大量膠原異常沉積，表現(xiàn)出的作用是促進(jìn)肝纖維化。SUMO-1可可以修飾其他生長因子，維持相關(guān)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而調(diào)控肝纖維化甚至的肝癌的發(fā)展過程。因此，我們設(shè)計該實(shí)驗進(jìn)一步研究SUMOs在肝纖維化過程中的作用及其機(jī)制，為肝纖維化的治療提供新的思路。本實(shí)驗首先利用Western blot及定量PCR檢測LPS刺激HSC-T6模擬肝纖維化的過程中SUMO-1表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步了解

5、SUMO-1在肝纖維化中的作用。然后我們通過針對SUMO-1慢病毒轉(zhuǎn)染LPS激活后的HSC-T6，利用Western blot及定量PCR證實(shí)SUMO-1的表達(dá)水平的確得到干擾及上調(diào)，再利用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞株的細(xì)胞周期及凋亡，以期闡明SUMO-1在肝纖維化中的作用機(jī)制。
　　第一部分不同濃度LPS刺激HSC-T6 SUMO-1的表達(dá)水平變化
　　目的:
　　探討能模擬肝纖維化時LPS刺激大鼠肝星狀細(xì)胞的最佳

6、濃度
　　方法:
　　分別用終濃度為0，1ug/ml，10ug/ml，100ug/ml，200ug/ml的LPS刺激HSC-T624小時后分別提取RNA及蛋白質(zhì)，后利用定量PCR及western blotting檢測SUMO-1的表達(dá)水平及利用western blotting檢測α-SMA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　定量PCR發(fā)現(xiàn)濃度為的10ug/ml LPS刺激HSC-T6其SUMO-1的表達(dá)水平最高，各組差

7、異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot驗證SUMO-1上述規(guī)律并且與α-SMA的表達(dá)規(guī)律一致，各組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　LPS能夠有效激活HSC-T6，在濃度為的10ug/mlLPS可最好模擬肝纖維化，與SMUO-1的表達(dá)規(guī)律一致。結(jié)果說明SMUO-1可能在LPS激活HSC-T6過程中取到一定作用。
　　第二部分SUMO-1表達(dá)變化后對HSC-T6增殖的影響及其機(jī)制研

8、究
　　目的:
　　初步探索SUMOs在HSC-T6激活過程中的作用及其機(jī)制
　　方法:
　　將人工合成的針對SUMO-1基因的siRNA慢病毒及SUMO-1過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染HSC-T6，采用定量PCR和Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后HSC-T6中SUMO-1的表達(dá)變化，并利用流式細(xì)胞儀檢測HSC-T6的周期及凋亡。后用Realtime PCR檢測SUMO-2及SUMO-3的表達(dá)水平。
　　結(jié)果

9、:
　　人工合成的針對SUMO-1基因的siRNA慢病毒能抑制肝星狀細(xì)胞中SUMO-1基因的表達(dá)但SUMO-2及SUMO-3的表達(dá)上調(diào)，而SUMO-1過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞后SUMO-1表達(dá)增強(qiáng)但SUMO-2及SUMO-3的表達(dá)水平下調(diào)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染后HSC-T6的周期及凋亡，各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　SUMO-1 siRNA沉默肝星狀細(xì)胞中S