大鼠RAG1基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、重組激活基因(RAGs)是一組具有穩(wěn)定的能夠激活重組反應(yīng)能力的DNA片段，最早由Schatz等于上個(gè)世紀(jì)80年代在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，有RAG1和RAG2兩種亞型。它們?cè)诹馨图?xì)胞的發(fā)育成熟過(guò)程中起關(guān)鍵作用，與免疫記憶功能有關(guān)，實(shí)驗(yàn)證明，敲除動(dòng)物的RAG1基因可導(dǎo)致免疫記憶功能缺陷。但隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)RAG1并非只存在于免疫系統(tǒng)中，在哺乳動(dòng)物，兩棲動(dòng)物和硬骨魚(yú)類(lèi)的神經(jīng)系統(tǒng)中也都存在。Chun等利用PCR、原位雜交和Northern

2、 blot分析檢測(cè)到在鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有RAG1的低水平轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物廣泛分布于胚胎和生后鼠的神經(jīng)元內(nèi)，轉(zhuǎn)錄最明顯發(fā)生于神經(jīng)細(xì)胞分布密集的腦區(qū)，小腦和海馬結(jié)構(gòu)，這些區(qū)域都與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。因此研究RAG1在與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的腦區(qū)表達(dá)是否跟學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)，對(duì)于開(kāi)發(fā)腦的功能，治療與學(xué)習(xí)記憶障礙有關(guān)的疾病等方面具有重要的意義。采用RAG1基因敲除技術(shù)雖可抑制該基因在免疫記憶中的作用，但同時(shí)又有可能引起胚胎期腦發(fā)育的異常，從而影響到出生

3、后腦的功能。因此采用基因敲除法來(lái)研究RAG1在神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)記憶功能顯然是不合適的。 RNA干擾技術(shù)是研究目的基因功能的一種新技術(shù)，與基因敲除法相比它有許多優(yōu)點(diǎn)，不僅可使目的基因?qū)崟r(shí)得到抑制，而且不影響動(dòng)物器官的發(fā)育，更有利于研究目的基因的功能，操作也更為簡(jiǎn)便。早期的RNA干擾技術(shù)因受載體影響，在體轉(zhuǎn)染率很低，一般只用于體外實(shí)驗(yàn)，而不能用于在體研究。隨著對(duì)病毒載體的不斷深入研究，RNA干擾片段可以由病毒包裝后導(dǎo)入體內(nèi)，轉(zhuǎn)染率也明

4、顯增高，使該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用范圍由體外研究轉(zhuǎn)入在體研究。然而目前尚未見(jiàn)到采用RNA干擾方法研究RAG1功能方面的文獻(xiàn)報(bào)道。為實(shí)現(xiàn)本課題組關(guān)于RAG1在腦功能方面的作用這一總的研究目標(biāo)，本課題擬構(gòu)建攜帶RAG1干擾片段的慢病毒載體，為實(shí)現(xiàn)在體研究腦內(nèi)RAG1的功能，并闡明RAG1與大腦學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 【目的】構(gòu)建RAG1RNAi慢病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元觀察其轉(zhuǎn)染效率及對(duì)RAG1表達(dá)的抑制效應(yīng)，篩選出高效且特異阻斷R

5、AG1基因表達(dá)的RNAi重組慢病毒表達(dá)載體。 【方法】 1.RAG1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)三對(duì)針對(duì)RAG1基因的shRNA(short hairpin RNA，shRNA)序列，分別命名為shRNA1、shRNA2、shRNA3，用限制性?xún)?nèi)切酶BamH Ⅰ+Xho Ⅰ將pRNAT-U6.2／Lenti載體酶切，將線(xiàn)性化的pRNAT-U6.2／Lenti和shRNA1、shRNA2、shRNA3分別進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，

6、對(duì)其產(chǎn)物酶切后進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定；采用慢病毒載體系統(tǒng)將pRsv-Rev，pMDLg／pRRE，pMD2.G三質(zhì)粒，分別與pRNAT-U6.2／Lenti—shRNA1／RAG1、pRNAT-U6.2／12nti-shRNA2／RAG1、pRNAT-U6.2／Lenti—shRNA3／RAG1共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞包裝成慢病毒載體；用慢病毒感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞，觀察各病毒的感染效率。 2.RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR收集感染96小

7、時(shí)的海馬神經(jīng)元提取總RNA，RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)RAG1mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢驗(yàn)。RT-PCR后，電泳分析PCR產(chǎn)物；實(shí)時(shí)熒光定量PCR后，對(duì)RNA產(chǎn)物進(jìn)行解離曲線(xiàn)分析，排除雙峰解離曲線(xiàn)或異常擴(kuò)增曲線(xiàn)的可能性，然后從各組樣品熒光定量PCR動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)中得出其熒光閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct)值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較，計(jì)算出各組待測(cè)樣品的RAG1拷貝數(shù)來(lái)檢測(cè)RAG1mRNA水平。 3.Western

8、blotting收集感染96小時(shí)的海馬神經(jīng)元提取蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并加抗體作用，借助ECL法進(jìn)行觀察。 【結(jié)果】 1.利用連接酶將pRNAT-U6.2／Lenti質(zhì)粒和shRNA1，shRNA2，shRNA3連接轉(zhuǎn)化可獲得陽(yáng)性質(zhì)粒pRNAT-U6.2／Lenti-shRNA1／RAG1、pRNAT-U6.2／Lenti-shRNA2／RAG1、pRNAT-U6.2／Lenti-shRNA3／

9、RAG1，經(jīng)鑒定shRNA能準(zhǔn)確完整地導(dǎo)入質(zhì)粒pRNAT-U6.2／Lenti中；采用慢病毒載體系統(tǒng)能獲得高滴度的重組慢病毒載體并能有效感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞使之產(chǎn)生siRNA。 2.分別將各組慢病毒表達(dá)載體感染培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元后，與未感染組細(xì)胞相比較，各感染組對(duì)RAG1mRNA和蛋白均有不同程度的抑制作用，其中shRNA3的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)RAG1蛋白和mRNA抑制率分別為(67±5.8)％和(77±5.0％)，未感染組和感染對(duì)照