seipin缺失對情感和認(rèn)知行為的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、先天性全身脂肪營養(yǎng)不良Ⅱ型(congenital generalized lipodystrophy type2，CGL2)的臨床特征是全身脂肪組織減少、脂糖代謝異常、精神發(fā)育遲滯(mentalretardation)。精神發(fā)育遲滯主要是指抑郁或焦慮等情感的障礙、認(rèn)知功能的低下。11號染色體長臂的seipin基因無義突變（seipin缺失）被認(rèn)為是CGL2的主要病理機(jī)制。seipin蛋白主要表達(dá)在脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和睪丸細(xì)胞。有研究證明

2、，脂肪細(xì)胞的seipin缺失通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferator-activated receptor gamma，PPARγ)的表達(dá)和活性，能阻礙脂肪細(xì)胞的分化，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞缺失。睪丸細(xì)胞seipin缺失可引起精子形態(tài)畸形。原位雜交檢測結(jié)果顯示seipin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦皮層、海馬、下丘腦、腦干和小腦等腦區(qū)選擇性高表達(dá)。但是有關(guān)seipin缺失對情感和認(rèn)知行為的影響迄今未見報道。

3、>　　抑郁癥患者腦內(nèi)PPARγ水平明顯低于正常人群。臨床研究已報道，PPARγ激動劑能有效地改善抑郁癥患者的癥狀。阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)患者腦內(nèi)的PPARγ水平也低于非認(rèn)知障礙人群，PPARγ激動劑能改善AD病人的認(rèn)知功能。PPARγ下調(diào)能抑制ERK1/2-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)信號通路的活性。海馬突觸傳遞的NMDA受體依賴型長時程增強(qiáng)(LTP)被認(rèn)為是認(rèn)知記憶的細(xì)胞模型，LTP的誘導(dǎo)

4、依賴于胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白啟動ERK1/2-CREB信號通路。有研究發(fā)現(xiàn)雌激素能正向調(diào)節(jié)PPARγ的表達(dá)。此外，Wei等報道了原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的seipin敲低能減少谷氨酸受體的表達(dá)和NMDA受體在細(xì)胞膜的分布。因此，神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失有可能通過降低腦的PPARγ水平影響情感和認(rèn)知行為。
　　研究目的:
　　1、明確seipin缺失對小鼠情感行為的影響及其性別差異。
　　2、探討seipin缺失對小鼠空間認(rèn)知行為的影響及

5、其分子機(jī)制。
　　第一部分 seipin缺失對小鼠情感行為的影響及其性別差異
　　實驗方法:
　　1.動物模型的制備和鑒定:全身seipin基因敲除(seipin-sKO)、神經(jīng)系統(tǒng)seipin基因敲除(seipin-nKO)和脂肪細(xì)胞seipin基因敲除(seipin-fKO)小鼠模型由北京大學(xué)劉國慶教授提供。提取尾部DNA，用PCR方法鑒定基因型。
　　2.動物行為學(xué)檢測:
　　(1)開場實驗(OFT)

6、:記錄運動的總路程、直立次數(shù)，分析自發(fā)活動情況;在中央?yún)^(qū)域的時間反映焦慮樣行為。
　　(2)高架十字迷宮實驗(EPM):記錄在開臂的時間，分析焦慮樣行為。
　　(3)強(qiáng)迫游泳實驗(FST):記錄保持不動的累積時間，分析抑郁樣行為。
　　(4)懸尾實驗(TST):記錄保持不動的累積時間，分析抑郁樣行為。
　　(5)游泳實驗:記錄游泳的時間，以游泳速度（距離/時間）分析運動功能。
　　(6)轉(zhuǎn)輪實驗:記錄不同轉(zhuǎn)

7、速下的掉落潛伏期，分析運動協(xié)調(diào)功能。
　　3.激素水平檢測:放射免疫法檢測血清雌激素、睪酮水平;ELISA檢測血清皮質(zhì)酮水平。
　　4.實時定量逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡法(Western blot):檢測海馬和皮層PPARγ mRNA和蛋白水平。
　　實驗結(jié)果:
　　1.與野生型（WT）小鼠相比，seipin-sKO雄/雌鼠顯示全身脂肪嚴(yán)重缺失，在OFT中央?yún)^(qū)域時間和在EPM開臂時間顯著減少

8、，在FST和TST的不動時間明顯延長;在游泳實驗中的游泳速度、轉(zhuǎn)輪實驗中的掉落潛伏期沒有明顯改變——seipin缺失誘發(fā)焦慮-抑郁樣行為，但不影響運動功能。
　　2.與對照組雄鼠相比，seipin-nKO雄鼠沒有脂肪組織的減少，但是顯示OFT中央?yún)^(qū)域時間和EPM開臂時間顯著減少，以及FST和TST的不動時間明顯延長。同樣與對照組雌鼠相比，seipin-nKO雌鼠也沒有脂肪組織減少，在OFT中央?yún)^(qū)域時間、EPM開臂時間、FST和TS

9、T的不動時間均沒有明顯差異——神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失誘發(fā)性別相關(guān)的焦慮-抑郁樣行為。
　　3.與對照組小鼠相比，seipin-fKO雄/雌鼠顯示全身脂肪組織萎縮，但是在OFT中央?yún)^(qū)域時間、EPM開臂時間、FST和TST的不動時間均沒有明顯差異——脂肪組織seipin缺失導(dǎo)致脂肪組織減少不影響情感行為。
　　4.同對照組相比，seipin-nKO雄/雌鼠的雌激素、雄激素和皮質(zhì)酮水平均沒有明顯的改變。同WT雌鼠相比，seipi

10、n-sKO雌鼠的雌激素水平降低。
　　5.雌激素處理能改善seipin-nKO雄鼠的焦慮-抑郁行為。seipin-nKO雌鼠的卵巢摘除能引起在EPM開臂停留時間減少，F(xiàn)ST和TST的不動時間延長——雌激素能改善seipin缺失所致的情感障礙。
　　6.與對照組相比，seipin-nKO雄鼠海馬皮層PPAR mRNA和蛋白水平明顯減少，但是seipin-nKO雌鼠的PPARγ表達(dá)沒有改變——seipin缺失能性別選擇性地減少神

11、經(jīng)系統(tǒng)PPARγ表達(dá)。雌激素能增加seipin-nKO雄鼠PPARγ表達(dá)，卵巢摘除導(dǎo)致seipin-nKO雌鼠的PPARγ減少——雌激素能緩解seipin缺失所致的PPARγ低表達(dá)。
　　7.PPARγ激動劑羅格列酮14天處理能改善seipin-nKO雄鼠焦慮-抑郁樣行為。
　　結(jié)論:
　　(1)神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失通過抑制PPARγ表達(dá)誘發(fā)焦慮-抑郁樣行為。
　　(2)雌激素能增加PPARγ表達(dá)，通過改善s

12、eipin缺失所致的PPARγ水平降低，能緩解seipin-nKO小鼠的焦慮-抑郁樣行為。
　　第二部分 seipin缺失對認(rèn)知行為的影響及其分子機(jī)制
　　實驗方法:
　　1.動物模型的制備和鑒定:同第一部分。
　　2.認(rèn)知行為的檢測:采用Morris水迷宮，記錄明臺實驗的游泳速度，檢測運動協(xié)調(diào)性和視覺靈敏性;記錄暗臺實驗的登臺潛伏期、撤臺實驗的目標(biāo)象限停留時間，分析空間學(xué)習(xí)記憶能力。
　　3.場電位記錄:

13、制備海馬冠狀切片，檢測海馬Schaffer側(cè)支-CA1突觸的興奮性突觸后電位(EPSP)、雙脈沖易化(PPF)以及高頻刺激(HFS，100Hz-100pulses)或θ條件刺激(100Hz-10 pulses)對長時程增強(qiáng)(LTP)的誘導(dǎo)。
　　4.全細(xì)胞膜片鉗記錄:制備海馬冠狀切片，檢測腦片海馬CA1錐體神經(jīng)元NMDA受體介導(dǎo)的電流(NMDA-indcued current，INMDA)和AMPA受體介導(dǎo)的電流（AMPA-ind

14、cued current，IAMPA）。
　　5.酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA):檢測海馬BDNF的水平。
　　6.RT-PCR:檢測谷氨酸AMPA受體和NMDA受體亞基mRNA水平。
　　7.Western blotting:檢測AMPA受體和NMDA受體亞基的表達(dá)，以及ERK1/2和CREB的磷酸化水平。
　　實驗結(jié)果:
　　1.與WT雄鼠相比，seipin-sKO雄鼠在水迷宮實驗中登臺潛伏期明顯延長

15、、撤臺后在目標(biāo)象限時間減少。與對照雄鼠相比，seipin-nKO雄鼠也表現(xiàn)登臺潛伏期明顯延長和目標(biāo)象限時間減少，但是seipin-fKO小鼠沒有顯示登臺潛伏期和目標(biāo)象限游泳時間的改變——神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。
　　2.與對照組相比，seipin-nKO雄鼠海馬Schaffer側(cè)支-CA1突觸的EPSP斜率明顯降低，不伴有PPF的比值改變——seipin缺失誘導(dǎo)突觸傳遞功能降低，但不影響突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

16、r>　　3.在對照組雄鼠，高頻刺激或θ條件刺激海馬Schaffer側(cè)支能引起CA1區(qū)EPSP斜率的長時程增加，即LTP的產(chǎn)生。但是，在seipin-nKO雄鼠同樣的條件刺激不能誘導(dǎo)LTP——seipin缺失損害LTP誘導(dǎo)。
　　4.同對照組相比，seipin-nKO雄鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元NMDA誘導(dǎo)的電流（INMDA）沒有差異，但是谷氨酸AMPA誘導(dǎo)的電流(IAMPA)幅值顯著減小。seipin-nKO雄鼠海馬AMPA受體亞基G

17、luR1和GluR2 mRNA和蛋白水平明顯低于對照組，但是NMDA受體亞基(NR1、NR2A和NR2B)表達(dá)沒有改變——seipin缺失選擇性抑制AMPA受體表達(dá)。
　　5.與對照組相比，seipin-nKO雄鼠海馬BDNF水平?jīng)]有改變;ERK和CREB磷酸化水平明顯降低——seipin缺失抑制ERK-CREB信號活性。
　　6.seipin-nKO雄鼠給予PPARγ激動劑羅格列酮3天處理能顯著提高ERK和CREB磷酸化水

18、平，增加AMPA受體表達(dá)和IAMPA幅值。MEK抑制劑U0126可以阻斷羅格列酮增加CREB的磷酸化——seipin缺失通過減少PPARγ水平抑制AMPA受體表達(dá)和功能。
　　7.seipin-nKO小鼠給予PPARγ激動劑羅格列酮能恢復(fù)突觸傳遞功能及LTP誘導(dǎo)，改善seipin-nKO小鼠的認(rèn)知障礙。U0126可以阻斷羅格列酮恢復(fù)AMPA受體的表達(dá)和功能，以及LTP誘導(dǎo)——seipin缺失通過抑制AMPA受體表達(dá)導(dǎo)致認(rèn)知障礙。<