mTOR抑制劑緩解比格犬蛛網(wǎng)膜下腔出血模型腦血管痙攣的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)的高死亡率和高致殘率主要與早期腦損傷(Early brain injury，EBI)和接下來(lái)出現(xiàn)的腦血管痙攣(Cerebralvasospasm，CVS)有關(guān)。盡管現(xiàn)在有許多針對(duì)CAS的治療方法，但成功治療的情況并不多見(jiàn)，而腦血管痙攣的發(fā)生機(jī)制仍是困擾大多數(shù)研究者的難題之一。
　　 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian tar

2、get of rapamycin，mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和蛋白質(zhì)合成中起著重要的作用。mTOR是PI3K/PKB(protein kinase B，PKB)信號(hào)通路下游的一個(gè)效應(yīng)蛋白，包括2種下游底物蛋白：70S核糖體6激酶S6K1(p70S6 kinase protein，S6K1)和4E-BP1(4E-binding protein1，4E-BP1)。
　　 作為一種蛋白激酶，mTO

3、R在細(xì)胞內(nèi)形成了兩種主要不同的多蛋白復(fù)合物，分別為mTORC1和mTORC2。雷帕霉素(rapamycin，mTOR抑制劑)僅能抑制mTORC1。AZD8055是一種新型的mTOR抑制劑，能抑制mTORC1和mTORC2，進(jìn)而抑制mTOR的活性。但mTOR抑制劑在血管痙攣中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的：
　　 采用犬兩次注血法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)模型，旨為研究mTOR通路蛋白在SAH后發(fā)生CVS時(shí)在血管壁，尤其

4、在血管平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)情況，觀察它們?cè)谡{(diào)節(jié)腦血管痙攣中的作用。應(yīng)用mTOR復(fù)合物1抑制劑(雷帕霉素)和mTOR復(fù)合物1/mTOR復(fù)合物2(mTOR C1/mTOR C2)抑制劑(AZD8055)，通過(guò)對(duì)mTOR通路下游蛋白P70S6K1和4E-BP1，以及增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen，PCNA)等能夠與增殖活動(dòng)相關(guān)因子的表達(dá)情況觀察，以研究mTOR信號(hào)通路中的重要因子，如mTOR、

5、P70S6K1和4E-BP1在蛛網(wǎng)膜下腔出血病程中的作用及可能的引發(fā)CVS的機(jī)理。
　　 材料與方法：
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為30只比格犬，雌雄不分，體重15～20kg。隨機(jī)平均分成5組，即假實(shí)驗(yàn)組(Sham，n=6)，蛛網(wǎng)膜下腔注血組(SAH，n=6)，蛛網(wǎng)膜下腔注血組結(jié)合應(yīng)用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)組(SAH+DMSO，n=6)，蛛網(wǎng)膜下腔注血組結(jié)合應(yīng)用雷帕酶素(2mg/kg體重，SAH

6、+RAPA，mTORC1抑制劑，n=6)和蛛網(wǎng)膜下腔注血組結(jié)合應(yīng)用AZD8055(2mg/kg體重，一種mTORC1/mTORC2抑制劑)組(SAH+AZD8055，n=6)。動(dòng)物采用乙酰丙嗪、阿托品和甲苯噻嗪全身麻醉后，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天(d0)和實(shí)驗(yàn)后的第2天(48h)，穿刺針刺破寰枕膜，放出適量腦脊液，將自體股動(dòng)脈的血液注射到蛛網(wǎng)膜下腔(小腦延髓池)，建立犬的蛛網(wǎng)膜下腔的兩次出血模型，在實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天(d0)和第實(shí)驗(yàn)后的第7天(d7)行血管造

7、影，觀測(cè)動(dòng)物的臨床行為學(xué)改變、基底動(dòng)脈的直徑。取基底動(dòng)脈行組織學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)染色和Western blot，檢測(cè)基底動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)變化及其血管壁中mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 肉眼觀察，蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)有大量的凝血塊分布于腦干的腹側(cè)Willis環(huán)的周圍，即出現(xiàn)在延髓腹側(cè)的延池、中腦的腳間池和視交叉池，以及基底動(dòng)脈的周圍。血管造影圖像中，7天(d7)的基底動(dòng)脈的平均直徑，與假

8、實(shí)驗(yàn)組相比，SAH組和SAH+DMSO組均出現(xiàn)了嚴(yán)重的基底動(dòng)脈痙攣(p<0.05)。而SAH組和SAH+DMSO組的7天(d7)與0天(d0)的基底動(dòng)脈的平均直徑的百分比分別是34.3±19.84％和38.4±10.26％，而假實(shí)驗(yàn)組的基底動(dòng)脈的平均直徑百分比是93.9±5.01％。在SAH+RAPA組和SAH+AZD8055組可見(jiàn)中度的血管痙攣，SAH+RAPA組和SAH+AZD8055組的7天(d7)與0天(d0)基底動(dòng)脈的平均直徑

9、的百分比分別是62.3±15.92％和65.2±10.34％，與SAH組和SAH+DMSO組相比，可見(jiàn)顯著性差異(p<0.05)。
　　 在臨床行為學(xué)飲食評(píng)分方面：從第2天到第4天，與SAH組相比，SAH+RAPA組和SAH+AZD8055組動(dòng)物的飲食情況明顯好轉(zhuǎn)，在實(shí)驗(yàn)后的5天至7天間，仍可見(jiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05，ANOVA)。但SAHRAPA組和SAH+AZD8055組之間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05，ANOVA)

10、。在活動(dòng)度評(píng)分方面：在實(shí)驗(yàn)后的6天至7天，與SAH組和SAH+DMSO組相比，SAH+RAPA組和SAH+AZD8055組動(dòng)物的活動(dòng)度明顯增強(qiáng)，可見(jiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05，ANOVA)。但SAH+RAPA組和SAH+AZDS055組之間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05，ANOVA)。在神經(jīng)功能障礙評(píng)分方面：大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯地神經(jīng)功能障礙的癥狀和體征，在所觀察的各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯(p>0.05)。
　　

11、通過(guò)對(duì)基底動(dòng)脈的HE染色后的形態(tài)學(xué)觀察，SAH組可見(jiàn)明顯的血管痙攣，即基底動(dòng)脈發(fā)生了明顯的收縮，管壁增厚，管腔直徑明顯縮小，內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌由于收縮而變短，內(nèi)彈力膜彎曲呈鋸齒狀，部分內(nèi)皮細(xì)胞失去了連續(xù)性并從內(nèi)彈力膜上脫離。SAH+RAPA和SAH+AZD8055組動(dòng)物的基底動(dòng)脈可見(jiàn)中等程度的血管痙攣。而假實(shí)驗(yàn)組(Sham)動(dòng)物的基底動(dòng)脈未見(jiàn)血管痙攣的表現(xiàn)。
　　 與假實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物相比，在SAH組和SAH+DMSO組中，基底動(dòng)

12、脈各層中，尤其是平滑肌細(xì)胞中的mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA的免疫組化染色均很明顯。用雷帕霉素和AZD8055治療的兩組動(dòng)物中，mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA的染色則都有明顯的減弱。雙熒光和三熒光免疫組化染色顯示，基底動(dòng)脈的各層中，尤其是在平滑肌層中，均可見(jiàn)mTOR、P70S6K1和PCNA的表達(dá)。雙色和三色免疫熒光圖像提示：mTOR與P70S6K1和PCNA共存。使用高變焦放大攝像，染色證實(shí)mTOR

13、、P70S6K1和PCNA共同定位于血管平滑肌細(xì)胞中。
　　 Western blotting顯示了血管痙攣動(dòng)脈中mTOR通路分子標(biāo)志物的表達(dá)，與假實(shí)驗(yàn)組相比，在蛋白電泳條帶上，可見(jiàn)SAH組和SAH+DMSO組動(dòng)物中，痙攣的基底動(dòng)脈中的mTOR、P70S6K1、4E-BP1并％PCNA的表達(dá)均有明顯增加。雷帕霉素和AZD8055明顯抑制了mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA的表達(dá)，可見(jiàn)顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)

14、。而在兩種抑制劑治療組之間、SAH組和SAH+DMSO組之間，mTOR、P70S6K1、4E-BP1和PCNA的表達(dá)未見(jiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 本研究顯示：在SAH后，mTOR通路的活化可能通過(guò)啟動(dòng)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，從而參與了基底動(dòng)脈痙攣的調(diào)控；在基底動(dòng)脈中觀察到了mTOR通路的mTOR、P70S6K1和4E-BP1與PCNA等多種因子的表達(dá)；應(yīng)用mTOR抑制劑--雷帕霉素和AZD8055后，mTOR