低聚甘露糖醛酸升高白細(xì)胞作用及機(jī)理研究.pdf

1、白細(xì)胞減少癥是腫瘤放化療過程中常見的一種并發(fā)癥，是指外周血液中的白細(xì)胞數(shù)目持續(xù)低于43109個/L，臨床表現(xiàn)主要以頭暈乏力，四肢酸軟，畏寒腰酸為主，若不及時治療可繼發(fā)嚴(yán)重感染并出現(xiàn)并發(fā)癥等。因此調(diào)節(jié)機(jī)體抗病能力，特別是抵抗癌治療后引起的白細(xì)胞減少，減少感染的發(fā)生率，成為提高抗癌治療質(zhì)量的關(guān)鍵性因素。
　　目前，臨床上治療白細(xì)胞減少癥的藥物以維生素類，嘌呤核苷酸類及輔酶類和集落刺激因子治療為主。上述藥物不同程度的存在著療效不甚理想，

2、價格昂貴，病人難以接受等弊端。因此開發(fā)有確切療效的，價格低廉，且無毒副作用的升高白細(xì)胞的藥物仍是臨床上的迫切需要。
　　褐藻膠是一類具有廣泛生物活性的物質(zhì)，我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，甘露糖醛酸的酶解產(chǎn)物能對抗γ射線引起的小鼠白細(xì)胞數(shù)量的下降，促進(jìn)小鼠造血系統(tǒng)的恢復(fù)。基上以上原因，本課題篩選了不同分子量的低聚甘露糖醛酸和低聚古羅糖醛酸在升高白細(xì)胞方面的活性，確定了升高白細(xì)胞作用的最佳有片段為分子量為5800的低聚甘露糖醛酸（以下簡稱M

3、5800）。進(jìn)一步以M5800為研究對象，研究其升高的白細(xì)胞的作用及機(jī)理。
　　本論文主要開展了以下的研究工作：
　　1.首先研究了不同分子量的低聚甘露糖醛酸和低聚古羅糖醛酸的理化性質(zhì)：以M5800為例：利用硫酸-咔唑法測定了M5800的糖醛酸含量為50.6％；利用HPGPC法測定了其重均分子量及分布系數(shù)分別為5.812KDa和1.080；測量了其比旋光度為-69.16°，pH值為6.51。
　　2.以環(huán)磷酰胺所致小鼠

4、骨髓抑制模型為藥效篩選平臺，分別研究了不同分子量的低聚甘露糖醛酸和低聚古羅糖醛酸對小鼠外周血白細(xì)胞的影響，并測定了小鼠血清中GM-CSF的水平。結(jié)果表明，除分子量為2000的低聚古羅糖醛酸外，其余5個受試藥均可不同程度地升高小鼠白細(xì)胞數(shù)量，同時可不同程度地升高小鼠血清中GM-CSF水平，其中以分子量為5800的低聚甘露糖醛酸的作用最為明顯。綜合以上二個指標(biāo)，分子量為5800的低聚甘露糖醛酸活性最強(qiáng)。
　　以環(huán)磷酰胺所致小鼠骨髓抑制

5、模型為藥效篩選平臺，以白細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞數(shù)為觀察指標(biāo)，進(jìn)一步研究了M5800的升白作用。結(jié)果表明，M5800在180mg/kg至540mg/kg范圍內(nèi)，均可明顯升高小鼠白細(xì)胞數(shù)量和骨髓有核細(xì)胞數(shù)量，與模型組比較有明顯差異。
　　3.在細(xì)胞水平上研究了M5800升高白細(xì)胞的作用機(jī)理：
　?。?）利用造血祖細(xì)胞體外瓊脂培養(yǎng)法，通過體內(nèi)給藥和體外給藥二種不同的給藥途徑，觀察 M5800對正常小鼠和模型小鼠粒-巨噬系造血祖細(xì)胞集落

6、（CFU-GM）增殖分化的影響；采用造血因子生物活性檢測法，研究經(jīng)M5800誘導(dǎo)制備的骨髓基質(zhì)細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的培養(yǎng)上清液對小鼠CFU-GM增殖分化的影響。結(jié)果表明，① M5800能明顯促進(jìn)正常小鼠CFU-GM集落的形成，與空白組比較，有顯著性差異。并且在3.125μg/mL到25μg/mL范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的加大，作用也逐漸增強(qiáng)，在25μg/mL時作用達(dá)到最大。② M5800體內(nèi)給藥，180mg/kg、360 mg/kg和54

7、0 mg/kg三個劑量組均能明顯促進(jìn)環(huán)磷酰胺模型小鼠CFU-GM的數(shù)量，與模型組比較，有極顯著性差異。③經(jīng)M5800誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，可明顯促進(jìn)CFU-GM的形成，在6.25μg/mL到50μg/mL范圍內(nèi)，與對照組比較，有明顯差異。經(jīng)M5800誘導(dǎo)的脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液，也能明顯促進(jìn)CFU-GM的形成，與對照組比較，有明顯差異。表明經(jīng)M5800誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中粒-巨噬系集落刺激因子（GM-CSF）的含量或活性增

8、加。
　?。?）利用MTT法，檢測了M5800對正常小鼠和環(huán)磷酰胺抑制模型小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，① M5800在6.25μg/mL到50μg/mL濃度范圍內(nèi)，能明顯促進(jìn)正常小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，并且在25μg/mL時作用達(dá)到最強(qiáng)。② M5800對環(huán)磷酰胺抑制小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖有一定促進(jìn)作用，其中50μg/mL組，與空白組比較，有顯著性差異。
　?。?）利用ELISA法研究M5800對骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌

9、GM-CSF和干細(xì)胞因子（SCF）的影響，利用MTT法研究M5800對脾淋巴細(xì)胞分泌白介素-3（IL-3）的影響。結(jié)果表明，① M5800在12.5μg/mL至50μg/mL濃度范圍內(nèi)，能明顯促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌GM-CSF，與空白組比較有明顯差異。② M5800在6.25μg/mL和50μg/mL范圍內(nèi)，能明顯促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌 SCF，與空白組比較有顯著性差異。③ M5800能明顯提高脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-3的能力，與空白組比較，有