miR146a參與HBV感染造成的肝細胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制的分子機制研究.pdf

1、研究目的:
　　 乙型肝炎病毒的感染(CHB)是嚴重威脅我國人類健康的重大傳染病，其遷延不愈的特點不僅給患者和社會帶來沉重的負擔，也對公共衛(wèi)生產(chǎn)生巨大隱患。Ⅰ型干擾素是目前治療CHB和相關(guān)疾病最常用的藥物，然而僅對約1/3的患者有效，且容易產(chǎn)生耐藥性，大大限制了其臨床治療效果，這種現(xiàn)象在臨床上稱為“干擾素抵抗”。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的主要原因是，HBV感染后機體免疫平衡被破壞，造成免疫功能低下或者紊亂。
　　 研究表明，HBV病

2、毒可以在分子、細胞、器官和個體等多個層次上對機體抗病毒天然免疫和獲得性免疫產(chǎn)生抑制和耐受，這是造成HBV感染容易慢性化的分子免疫基礎(chǔ)。肝臟免疫學認為，抑制進而完全清除HBV離不開機體抗病毒免疫反應(yīng)的激活，而正常的免疫功能也是藥物治療取得理想療效不可或缺的因素。然而，目前以針對“干擾素抵抗”為代表的HBV負向免疫調(diào)節(jié)作用的研究相對滯后，限制了抗HBV免疫治療藥物的開發(fā)。
　　 miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類主要在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因表

3、達進行調(diào)節(jié)的短片段非編碼RNA。在哺乳動物細胞內(nèi)，miRNA可通過序列特異性的不完全互補作用抑制靶基因mRNA的翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在抗病毒天然免疫反應(yīng)中，既可以成為典型的基因調(diào)控因子，也能夠成為直接靶向轉(zhuǎn)錄物而發(fā)揮干擾作用的免疫效應(yīng)分子。同時，在HBV的致病過程中，宿主miRNA同樣參與了病毒復制、轉(zhuǎn)錄、包裝等自身生命活動，通過調(diào)控宿主基因參與了炎癥反應(yīng)、免疫損傷、促進自身潛伏、誘發(fā)繼發(fā)性疾病乃至肝癌，成為研究HBV與宿主相互作

4、用的重要窗口。
　　 本研究的目的是通過對HBV存在條件下肝細胞內(nèi)miRNA表達水平的檢測和篩選，尋找可能參與HBV誘導胞內(nèi)天然免疫抑制，特別是“干擾素抵抗”的miRNA。通過干預miRNA的表達水平，分析相關(guān)miRNA與HBV感染之間的關(guān)系，并研究其是否參與了HBV造成的肝細胞胞內(nèi)抗病毒免疫應(yīng)答信號的調(diào)節(jié)，探究其與“干擾素抵抗”是否相關(guān)。利用生物信息學和分子生物學的手段鑒定在這一過程中miRNA發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶分子，并尋找HB

5、V感染與相關(guān)分子之間動態(tài)水平的關(guān)聯(lián)。最后，利用HBV復制性小鼠模型，研究靶向干預特定miRNA能否改變HBV的體內(nèi)感染過程，為開發(fā)基于miRNA的新型抗HBV免疫藥物提供理論和實驗依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 首先，以整合了HBV全基因組的HepG2.2.15細胞和無HBV存在的對照細胞HepG2為模型，利用miRNA特異性RT和qPCR兩種技術(shù)，我們定量分析了細胞內(nèi)與免疫相關(guān)的15種miRNA的豐度，觀察了HBV感染

6、對肝細胞內(nèi)免疫相關(guān)miRNA的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)miR146家族的兩個成員，特別是miR146a在HBV整合的肝細胞系內(nèi)的表達明顯高于對照細胞，并通過核糖核酸酶保護實驗確認了miR146a在兩種細胞系內(nèi)的絕對水平;在HepG2.2.15細胞和HepG2細胞中，利用特異性引物并通過RT-qPCR定量分析miR146a初級轉(zhuǎn)錄物和次級前體的表達，并采用熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治鰞煞N細胞中miR146a啟動子的活性。
　　 其次，通過基因工

7、程的方法，我們構(gòu)建了HBV全基因組和四種主要蛋白元件的真核表達載體，并分別將其轉(zhuǎn)染到HepG2細胞中，利用RT-qPCR技術(shù)檢測了HBV基因組及其蛋白組分的存在對肝細胞內(nèi)miR146a表達的影響。同時，我們利用HBV全基因組表達載體尾靜脈高壓注射的方法建立了HBV復制性小鼠模型，通過灌流法分離小鼠肝實質(zhì)細胞，接著用RT-qPCR法檢測了其中miR146a的表達，同時用ELISA法檢測了小鼠血清中HBsAg的水平，分析了二者之間的關(guān)系，并

8、再次確認了HBV存在對miR146a表達水平的影響。
　　 接下來，我們將化學合成的miR146a抑制物轉(zhuǎn)染入高表達miR146a的HepG2.2.15細胞，利用RT-qPCR和ELISA檢測其對HBV轉(zhuǎn)錄和抗原表達的影響。與此同時，將miR146a模擬物或其過表達載體與HBV全基因組載體聯(lián)合轉(zhuǎn)染低表達miR146a的HepG2細胞，檢測了其對HBV轉(zhuǎn)錄和抗原表達的影響。為進行體內(nèi)研究，我們構(gòu)建了靶向miR146a家族成員的mi

9、R146asponge沉默載體與miR146a過表達載體pcDNA3-miR146a，然后分別與HBV全基因組載體配伍，聯(lián)合高壓注射小鼠，ELISA檢測小鼠血清HBsAg和HBeAg的含量，并用免疫組織化學分析小鼠肝組織HBsAg和HBcAg的表達，探索了體內(nèi)靶向干預肝細胞內(nèi)miR146a的表達水平后對HBV體內(nèi)感染周期的影響。
　　 在分析miR146a對Ⅰ型干擾素信號轉(zhuǎn)導通路影響研究中，首先對miR146a進行干預，然后再進

10、行Ⅰ型干擾素處理，利用RT-qPCR和WesternBlotting技術(shù)比較干預前后細胞中MxA、ISG15、OAS-1、IFIT3等主要抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平;在先期相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，比較了兩種細胞miR146a靶基因-轉(zhuǎn)錄因子STAT1的表達;構(gòu)建了包含miR146a識別區(qū)域的UTR的熒光素酶報告基因載體，并用于評價靶基因翻譯活性。采用熒光素酶報告基因?qū)嶒灒覀兎治隽薙TAT1發(fā)生差異表達的分子基礎(chǔ);在此基礎(chǔ)上，利用miR1

11、46a過表達和沉默策略，檢測了肝細胞中miR146a調(diào)控STAT1表達的機制，并通過改變肝細胞內(nèi)miR146a的水平，分析了miR146a對STAT1翻譯活性的調(diào)節(jié)作用。通過對HBV陽性和陰性肝細胞癌臨床標本的分析，我們進一步確認了STAT1的表達與HBV感染之間存在相關(guān)性。
　　 最后，通過生物信息學手段，我們分析了可能參與抗HBV天然免疫應(yīng)答過程的17種干擾素誘導基因與miR146a之間的關(guān)系，其中有三個基因被預測可能成為m

12、iR146a的直接靶點。我們構(gòu)建了針對IFIT3的UTR區(qū)熒光素酶報告基因載體，證實了IFIT3是miR146a的一個新的直接靶點。在兩種模型細胞中，我們比較了該基因和已知miR146a靶基因TRAF6翻譯活性與miR146a表達水平之間的關(guān)系?；谝阎腎FIT3和TRAF6生物學功能，我們又通過體外轉(zhuǎn)錄合成了RLR信號通路的配基5'ppp-RNA(簡稱3p-RNA)。首先通過預先沉默miR146a的方法，利用RT-qPCR分析了肝細

13、胞對3p-RNA免疫刺激作用的敏感性;接著進行IFIT3過表達實驗，利用RT-qPCR和ELISA方法，分析其對肝細胞3p-RNA刺激的正向作用和直接抗HBV活性;通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治隽薽iR146a對肝細胞內(nèi)TRAF6翻譯的調(diào)節(jié)作用。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.肝癌細胞內(nèi)miR146a的高表達與HBV感染密切相關(guān)
　　 HBV感染造成了多種免疫相關(guān)miRNA的表達水平發(fā)生變化，其中以miR146家族最

14、為明顯;在整合有HBV的肝癌細胞系HepG2.2.15和PLC/PRF/5中，miR146a的表達水平明顯高于無HBV存在的陰性細胞系;HepG2.2.15中miR146a初級轉(zhuǎn)錄本和頸環(huán)前體的表達也明顯高于對照細胞HepG2;HBV感染引起miR146a上調(diào)依賴于NF-κB。
　　 2.HBV感染引起了肝細胞內(nèi)miR146a表達水平的升高
　　 我們成功建立HBV完整基因組和四個主要蛋白成分X蛋白、核心蛋白、表面抗原小

15、蛋白和HBV的DNA多聚酶的真核表達載體;瞬時轉(zhuǎn)染HBV全基因組載體后，HepG2細胞中miR146a的表達水平明顯提高，并且HBV基因組表達載體穩(wěn)定化的HepG2細胞也有相同的現(xiàn)象;HBV的四個主要的蛋白產(chǎn)物對上調(diào)肝細胞miR146a的表達有共同但不均等的貢獻;在HBV復制性小鼠中，小鼠原代肝實質(zhì)細胞內(nèi)miR146a的表達與血清HBsAg的表達水平呈一定程度的正相關(guān)。
　　 3.miR146a可以促進HBV的復制和轉(zhuǎn)錄

16、　　 流式細胞術(shù)結(jié)果證實，熒光標記的miR146a模擬物和阻遏物可以有效的導入靶細胞。定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們均可以有效地改變肝細胞內(nèi)源性miRNA的表達水平;我們自行設(shè)計構(gòu)建的miR146asponge載體也可以有效地沉默HepG2.2.15細胞內(nèi)miR146a的水平;
　　 在上述實驗系統(tǒng)的支撐下，在HepG2細胞模型中，進行模擬物或者質(zhì)粒載體過表達miR146a，可以促進瞬轉(zhuǎn)HBV的轉(zhuǎn)錄，而通過阻遏物或者質(zhì)粒載體沉默

17、miR146則可以抑制HBV的轉(zhuǎn)錄和翻譯。通過尾靜脈高壓注射的的方式向小鼠肝臟輸送miR146a過表達載體，可以升高小鼠血清HBsAg和HBeAg抗原的表達水平和肝細胞內(nèi)HBsAg的表達，而輸送靶向miR146a的sponge沉默載體后，小鼠血清HBsAg和HBeAg抗原的含量明顯降低，且肝細胞內(nèi)HBsAg的表達亦顯著下降。同時，抑制miR146a的水平不影響HepG2.2.15細胞的增殖;miR146b模擬物和HBV全基因組載體共轉(zhuǎn)染

18、HepG2細胞并不能明顯影響HBV的轉(zhuǎn)錄，miR146b模擬物轉(zhuǎn)染也未影響HepG2.2.15細胞分泌HBV抗原的能力。
　　 基于RNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和保守性的生物信息學預測認為，miR146a不會直接靶向HBVRNA。
　　 4.miR146a可以抑制肝細胞內(nèi)Ⅰ型干擾素的信號轉(zhuǎn)導
　　 將miR146a模擬物轉(zhuǎn)染入HepG2細胞后，可以抑制細胞對后續(xù)IFN-α刺激的應(yīng)答，表現(xiàn)為ISG15、MxA、OAS-1、

19、IFIT3等干擾素誘導基因轉(zhuǎn)錄的減弱和蛋白合成的下降。在miR146a穩(wěn)定過表達的HepG2細胞上，也可以觀察到類似的現(xiàn)象;而將miR146a阻遏物轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細胞后，則會產(chǎn)生相反的作用，表現(xiàn)為ISG15、MxA、OAS-1、IFIT3等干擾素誘導基因轉(zhuǎn)錄的增強和蛋白合成的增加。
　　 5.HBV感染誘導的miR146a的高表達抑制了肝細胞內(nèi)STAT1的水平
　　 HepG2.2.15細胞中STAT1的基礎(chǔ)

20、表達水平低于HepG2;與臨床HBV陰性肝細胞癌細胞相比，HBV陽性肝細胞癌細胞中STAT1的水平明顯降低;將miR146a阻遏物轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細胞后，可以明顯上調(diào)STAT1蛋白的表達，而不影響胞內(nèi)mRNA的水平，而轉(zhuǎn)染miR146a的模擬物則會產(chǎn)生相反的結(jié)果。報告基因檢測顯示，HepG2.2.15細胞中STAT1的基礎(chǔ)翻譯水平明顯低于HepG2細胞，這可能是其蛋白表達低于HepG2的原因之一;提高HepG2細胞內(nèi)miR14

21、6a的水平可以序列依賴性地抑制STAT1的翻譯，而抑制HepG2.2.15細胞內(nèi)miR146a的水平則能夠序列依賴性地促進STAT1的翻譯。
　　 6.人IFIT3基因是miR146a的一個新的直接靶基因
　　 利用四種生物信息學軟件，我們對17種抗HBV宿主基因與miR146a關(guān)系進行分析，其中有三個基因可能成為miR146a的直接靶基因，分別是IFIT3、RIG-I和RNaseL;針對IFIT3的熒光素酶報告實驗證實

22、，IFIT3是miR146a的直接靶基因。
　　 HepG2.2.15細胞中IFIT3基因的基礎(chǔ)翻譯水平低于HepG2細胞，且與STAT1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)相似，HepG2.2.15細胞中IFIT3基因的翻譯水平受到胞內(nèi)miR146a的抑制，向HepG2.2.15細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR146a抑制物能夠序列依賴性地促進IFIT3的翻譯。
　　 7.miR146a抑制了肝細胞內(nèi)5'ppp-RNA刺激對Ⅰ型干擾素的誘導作用
　　

23、 向HepG2.2.15細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR146a抑制物后，5'ppp-RNA對HepG2.2.15細胞的免疫刺激作用顯著增強，促進內(nèi)源性Ⅰ型干擾素的誘導表達;在HepG2.2.15細胞內(nèi)過表達IFIT3后，同樣可以促進5'ppp-RNA引起的Ⅰ型干擾素的誘生。
　　 另一種參與天然免疫應(yīng)答并誘導Ⅰ型干擾素的分子TRAF6，也受到miR-146a的轉(zhuǎn)錄后抑制，其在HepG2.2.15細胞中的翻譯明顯低于HepG2細胞。這可能是mi

24、R146a通過轉(zhuǎn)錄后抑制方式參與HBV感染肝細胞后內(nèi)源性Ⅰ型干擾素誘導的新的分子機制。
　　 將IFIT3過表達載體轉(zhuǎn)入HepG2.2.15后，胞內(nèi)HBVmRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著受到明顯抑制，提示IFIT3可能具有直接的抗HBV活性。
　　 結(jié)論:
　　 1.HBV基因組的肝癌細胞系HepG2.2.15中miR146a的表達水平顯著高于HepG2細胞，主要分子機制是轉(zhuǎn)錄活性增強。
　　 2.miR146a的

25、存在促進了HBV的生命活動和自身存續(xù)，生物信息學預測顯示這種作用很可能不是通過直接與病毒RNA相互作用實現(xiàn)的。
　　 3.miR146a通過對靶基因STAT1翻譯的抑制，負調(diào)了肝細胞對Ⅰ型干擾素誘導的抗病毒反應(yīng)的應(yīng)答能力，而抑制miR146a的功能則可以提高Ⅰ型干擾素體內(nèi)外抗病毒效果。
　　 4.人IFIT3是miR146a的直接的靶基因之一，且可能具有直接的抗HBV作用。
　　 5.miR146a通過對靶基因I

26、FIT3和TRAF6翻譯的抑制，負調(diào)5'ppp-RNA對肝細胞內(nèi)源性Ⅰ型干擾素的誘導，而抑制miR146a的功能可以增強5'ppp-RNA的刺激作用，促進Ⅰ型干擾素的轉(zhuǎn)錄和表達。
　　 意義:
　　 miR146a高表達是HBV感染改變肝細胞表觀遺傳狀態(tài)的主要表現(xiàn)之一;它通過調(diào)控多種與內(nèi)源性Ⅰ型干擾素誘導和激活有關(guān)的信號分子，對胞內(nèi)抗病毒天然免疫產(chǎn)生鈍化作用，而有利于HBV的存續(xù);靶向沉默miR146a則能夠打破HBV感