肝干細(xì)胞移植治療暴發(fā)性肝功能衰竭的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分肝干細(xì)胞移植治療暴發(fā)性肝功能衰竭大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.目的：建立成年大鼠肝干細(xì)胞增殖模型,進(jìn)一步進(jìn)行肝干細(xì)胞的分離、純化和鑒定,并移植治療大鼠暴發(fā)性肝功能衰竭模型,以探索肝干細(xì)胞移植治療暴發(fā)性肝功能衰竭的可行性及有效性.方法：為確定建立大鼠肝干細(xì)胞增殖模型的最佳給藥劑量和時(shí)間雄性,將健康成年Wistar大鼠按二乙酰氨基芴給予劑量不同隨機(jī)分為5組(5、10、15、20、25mg/kg B.W.),按各自劑量每天一次連續(xù)灌胃處理給予二乙酰

2、氨基芴,第5天行標(biāo)準(zhǔn)的2/3肝切除術(shù)(手術(shù)當(dāng)天不給予),術(shù)后按術(shù)前各自劑量繼續(xù)給予二乙酰氨基芴,觀察動(dòng)物耐受性,并于術(shù)后3、7、11、14天取病理標(biāo)本,光鏡及電鏡下觀察肝干細(xì)胞增殖情況,并進(jìn)行SABC免疫組織化學(xué)染色以進(jìn)一步鑒定是否符合肝干細(xì)胞的表型特點(diǎn),并與單純給予二乙酰氨基芴組及單純肝切除手術(shù)組進(jìn)行對照;選擇15mg/kg B.W.劑量每天一次連續(xù)灌胃處理給予二乙酰氨基芴,第5天行2/3肝切除術(shù),術(shù)后按相同劑量繼續(xù)給予11天,建立雄

3、性大鼠肝干細(xì)胞增殖模型,以此模型為供體,利用改進(jìn)的Seglen膠原酶原位灌注及Percoll密度梯度離心分離、純化大鼠肝干細(xì)胞,在倒置顯微鏡、電鏡下觀察細(xì)胞特點(diǎn),免疫組織化學(xué)染色鑒定肝干細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志,如甲胎蛋白、細(xì)胞角蛋白18和19、白蛋白及白細(xì)胞共同抗原,純化的肝干細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)液調(diào)整濃度1×10<'6>/ml于CO<,2>培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃,5％CO<,2>)培養(yǎng);雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為治療組(A組)和對照組(B組),10

4、％D-氨基半乳糖(1200 mg/kg B.w.)腹腔一次注射誘導(dǎo)暴發(fā)性肝功能衰竭大鼠模型,給藥24 h后取培養(yǎng)24 h細(xì)胞懸液0.4 ml(10<'7>細(xì)胞/ml)于肝臟中葉注射移植,對照組注射相同體積培養(yǎng)液,于移植前及移植后24、48、72 h及1 w取血測定肝功能指標(biāo)如血氨、ALT、AST、TBiL,并采取肝臟標(biāo)本進(jìn)行病理檢查,于移植后1 w、2 w及4 w取雌性受體原位(注射部位)、鄰位(距注射部位1.5cm)肝臟組織應(yīng)用PCR

5、方法進(jìn)行性別決定因子(Sry)基因分析,以鑒定移植后雌性受體肝臟組織是否存在雄性供體肝干細(xì)胞.結(jié)論：采用二乙酰氨基芴灌胃處理,聯(lián)合2/3肝切除可成功誘導(dǎo)成年雄性Wistar大鼠的肝干細(xì)胞增殖模型;改進(jìn)的Seglen膠原酶原位灌注結(jié)合Percoll密度梯度離心可分離、純化肝干細(xì)胞,符合肝干細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)及超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn),免疫組化染色具有雙向表型細(xì)胞標(biāo)志特點(diǎn)(肝細(xì)胞表型:甲胎蛋白及細(xì)胞角蛋白18陽性,膽管細(xì)胞表型:細(xì)胞角蛋白19陽性),體外培

6、養(yǎng)2~3 w內(nèi)可形成克隆樣結(jié)構(gòu);肝干細(xì)胞經(jīng)肝臟移植可延長暴發(fā)性肝功能衰竭大鼠模型的存活時(shí)間,改善血清TBiLL、血氨等肝功能指標(biāo),改善病理結(jié)果,促進(jìn)肝細(xì)胞再生,可見卵圓形核的小細(xì)胞增殖,隨時(shí)間延長逐漸增多并具有向肝細(xì)胞及小膽管分化的趨勢;治療組存活2 w大鼠肝臟組織中Sry陽性表達(dá),隨時(shí)間延長表達(dá)增強(qiáng),且鄰位肝組織也呈陽性結(jié)果,可以推論雄性供體肝干細(xì)胞移植后在雌性受體體內(nèi)能定植存活,并能增殖分化.第二部分人胎兒肝干細(xì)胞移植治療暴發(fā)性肝功

7、能衰竭SCID小鼠的實(shí)驗(yàn)研究.目的：建立人胎兒肝干細(xì)胞的分離及純化方法,并進(jìn)行鑒定,異種移植治療SCID小鼠暴發(fā)性肝功能衰竭模型,觀察人胎兒肝干細(xì)胞移植治療暴發(fā)性肝功能衰竭的可能性及有效性.方法：以4~6個(gè)月水囊引產(chǎn)男性胎兒為細(xì)胞供體,利用改進(jìn)的Seglen膠原酶(Ⅳ型)原位灌注分離肝細(xì)胞懸液,所獲細(xì)胞平均分為兩部分,分別以Percoll密度梯度離心及11μm孔徑濾膜過濾兩種方法純化肝干細(xì)胞,再將純化的肝干細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)液調(diào)整濃度1

8、×10<'6>/ml于CO<,2>培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃,5％CO<,2>),光鏡、電鏡下觀察細(xì)胞特點(diǎn),進(jìn)行肝干細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志如甲胎蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、細(xì)胞角蛋白8及19等SABC免疫組化染色以進(jìn)一步鑒定所分離細(xì)胞特點(diǎn).將1 50只雌性SCID小鼠,按D-氨基半乳糖劑量不同隨機(jī)分為5組(400,800,1200,1600及2000 mg/kg B.W.),于給藥前及給藥后1、2、3 d及1 w取血測定血氨、血清ALT、AST及TBiL水

9、平,并取肝臟、心、肺、腎等組織進(jìn)行病理檢查.用以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果所確定劑量建立SCID小鼠暴發(fā)性肝功能衰竭(1600 mg/kgB.W.)與急性肝損傷模型(800 mg/kgB.W.),給藥24 h后治療組雌性SCID小鼠暴發(fā)性肝功能衰竭與急性肝損傷模型經(jīng)肝臟左葉注射移植0.1ml培養(yǎng)24 h的人胎兒肝干細(xì)胞懸液(10<'7>/ml),對照組注射相同體積培養(yǎng)液,于移植前及移植后24、48、72 h及1 w取血測定血氨、ALT、AST、TBiL

10、,于移植后1、2及4 w取雌性受體原位(注射部位)、鄰位(距注射部位0.5cm)肝臟組織,應(yīng)用PCR方法進(jìn)行性別決定因子(SRY)基因分析.結(jié)論：改進(jìn)的Seglen膠原酶原位灌注結(jié)合Percoll密度梯度離心或11 μm濾網(wǎng)過濾均可分離、純化人胎兒肝干細(xì)胞,所得細(xì)胞符合肝干細(xì)胞的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn),免疫組化染色具有雙向表型細(xì)胞標(biāo)志特點(diǎn)(肝細(xì)胞表型:甲胎蛋白及α-1-抗胰蛋白酶陽性,膽管細(xì)胞表型:細(xì)胞角蛋白8、19陽性),體外培養(yǎng)2~3

11、w內(nèi)可形成克隆樣結(jié)構(gòu);D-氨基半乳糖腹腔一次注射可成功誘導(dǎo)SCID小鼠暴發(fā)性肝功能衰竭及急性肝損傷模型;人胎兒肝干細(xì)胞注射移植于肝臟能延長暴發(fā)性肝功能衰竭SCID小鼠模型的存活時(shí)間,改善暴發(fā)性肝功能哀竭及急性肝損傷SCID小鼠模型血清TBiL、血氨等肝功能指標(biāo);肝臟病理結(jié)果均改善,可見卵圓形核的小細(xì)胞增殖,并具有向肝細(xì)胞及小膽管分化的趨勢,肝干細(xì)胞移植后存活2 w治療組肝臟組織中SRY陽性表達(dá),隨時(shí)間延長表達(dá)增強(qiáng),且暴發(fā)性肝功能衰竭組表

12、達(dá)強(qiáng)于急性肝損傷組,可以推論男性供體的人胎兒肝干細(xì)胞在雌性SCID小鼠體內(nèi)移植后能定植、增殖分化,且增殖分化和肝臟局部微環(huán)境有一定的關(guān)系.第三部分加味茵陳湯治療暴發(fā)性肝功能衰竭大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.目的：探索中藥加味茵陳湯對暴發(fā)性肝功能衰竭大鼠的治療效果,建立大鼠肝細(xì)胞體外損傷模型,并觀察加味茵陳湯含藥血清對體外肝細(xì)胞損傷模型的作用,以進(jìn)一步驗(yàn)證此方劑的作用.方法：加味茵陳湯(茵陳、梔子、大黃、三七、丹參、赤芍、生地、丹皮、白芍、柴胡)以自動(dòng)

13、煎藥包裝機(jī)制成湯劑(2 g生藥/ml),D-氨基半乳糖腹腔內(nèi)一次注射以制備大鼠暴發(fā)性肝功能衰竭模型,劑量1200 mg/kgB.W.,給藥后隨即分別以不同劑量中藥灌胃(A組:45 g/kg B.W.,相當(dāng)于60kg體重成人劑量15倍;B組:30g/kgB.W.,相當(dāng)于成人劑量10倍;C組:15 g/kg B.W.,相當(dāng)于成人劑量5倍)治療大鼠模型,對照組(D組)模型大鼠給予相同體積生理鹽水,觀察一般情況改變及生存時(shí)間,于給藥前、給藥后2

14、4、48、72 h取血測定血氨、AST、ALT及TBil,并取肝臟進(jìn)行病理檢查.利用改進(jìn)的Seglen膠原酶(Ⅳ型)原位灌注分離大鼠肝細(xì)胞,培養(yǎng)液中加入不同濃度D-氨基半乳糖(0.2 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml、25μg/ml、125 μg/ml)培養(yǎng)24 h,于培養(yǎng)1、3、6、12、24 h取上清測定ALT、AST、LDH,同步測定肝細(xì)胞的MTT反應(yīng)以建立肝細(xì)胞體外損傷模型;以確定劑量中藥加味茵陳湯(30 g/kgB.

15、W.,相當(dāng)于60kg體重成人劑量10倍)灌胃給予大鼠制備中藥藥物血清,于肝細(xì)胞體外損傷模型加入5％、10％、15％濃度的藥物血清培養(yǎng)24 h,以NS及正常大鼠血清做對照,于培養(yǎng)1、3、6、12、24 h取上清測定ALT、AST、LDH,同步測定肝細(xì)胞的MTT反應(yīng),并于倒置顯微鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)變化.結(jié)論：中藥加味茵陳湯可以延長D-GalN誘導(dǎo)大鼠暴發(fā)性肝功能衰竭模型的生存時(shí)間,改善存活率及TBiL及血氨等肝功能指標(biāo),減輕肝臟損傷的病理改

16、變;濃度25 μg/ml的D-GalN加入培養(yǎng)體系可以成功誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞體外損傷模型,以6 h作用最為明顯;選擇30 g/kg B.W.劑量(相當(dāng)于60 kg體重成人劑量10倍),采用每日給藥2次,連續(xù)給藥3天,末次給藥后1小時(shí)采血的方案可成功制備含中藥血清;此血清以不同濃度加入肝細(xì)胞體外損傷模型,可以降低AST、ALT及LDH等肝細(xì)胞損傷指標(biāo),增加細(xì)胞活性,隨濃度增加而作用增強(qiáng),從細(xì)胞水平證實(shí)加味茵陳湯具有保肝降酶,促進(jìn)肝細(xì)胞再生等功