骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠急性肝功能衰竭治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 干細(xì)胞是指一類具有自我增殖能力和分化潛能的細(xì)胞，在特定的條件下可以分化為不同的功能細(xì)胞，甚至形成多種組織和器官。因此，干細(xì)胞的研究己成為生命科學(xué)的一個(gè)重要領(lǐng)域。業(yè)已證實(shí)，成年個(gè)體骨髓內(nèi)存在具有多向分化特性的干細(xì)胞，在體內(nèi)和體外不同的微環(huán)境下，這些多潛能干細(xì)胞可以分化成三個(gè)胚層來源的細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)如皮膚和神經(jīng)細(xì)胞，肝細(xì)胞和胰腺細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等，顯示了成體骨髓多功能干細(xì)胞極高的可塑性。這

2、對于各種先天性疾病、老年性疾病和各種原因所致的組織缺損具有重要的應(yīng)用前景。 目前備受關(guān)注的干細(xì)胞主要有胚胎干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，造血干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等。胚胎干細(xì)胞由于其無與倫比的增殖能力和分化潛能而成為干細(xì)胞研究較為理想的模型，但由于存在論理學(xué)的問題胚胎干細(xì)胞的研究仍然受到限制。相對間充質(zhì)干細(xì)胞的研究卻日益顯示了其強(qiáng)大的生命力，這主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)首先間充質(zhì)干細(xì)胞從增殖能力和分化潛能上具備干細(xì)胞最基本的特點(diǎn)，其

3、分化潛能不僅僅局限于中胚層組織，而且在特定的條件下可以向內(nèi)胚層和外胚層的組織細(xì)胞分化；(2)成年個(gè)體一生中均具備間充質(zhì)干細(xì)胞庫，這也可能是成年個(gè)體組織更新和組織修復(fù)的必備前提，而且由于成體干細(xì)胞在定向分化進(jìn)行組織修復(fù)中不存在主要組織相容性復(fù)合物的限制的特性，使得成體干細(xì)胞在治療上的前景更加廣闊；(3)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的取材和分離非常容易，培養(yǎng)條件相對成熟，已經(jīng)可以在體外大量擴(kuò)增。 急性肝衰竭仍是一種死亡率較高的疾病，肝移植是治療

4、這種疾病的一種有效方法。但肝移植存在許多問題，如：供體缺乏、手術(shù)創(chuàng)傷大、排異、費(fèi)用昂貴等。所以，迫切需要其他可以選擇的治療急性肝衰竭的方法。肝細(xì)胞移植可作為肝臟移植的一種替代方法，但同樣存在著供體來源受限問題，同時(shí)肝細(xì)胞的獲取具有很大的創(chuàng)傷性。干細(xì)胞的研究為解決這個(gè)問題提供了新的希望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有極強(qiáng)的多向分化潛能，國內(nèi)外許多研究已證明其在體內(nèi)、體外可分化為肝細(xì)胞。同時(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的來源充足，易于獲得，作為組織干細(xì)胞的一種，

5、增殖能力強(qiáng)，體外能大量擴(kuò)增，能滿足細(xì)胞移植要輸入大量功能細(xì)胞的要求。病人可使用自體骨髓移植，完全克服免疫排斥，從根本上解決器官移植面臨的免疫排斥問題。 Jang YY等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)造血干細(xì)胞與受損的肝細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，造血干細(xì)胞在7個(gè)小時(shí)內(nèi)就可轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞。Makowka L等報(bào)道腹腔內(nèi)移植骨髓干細(xì)胞可提高D-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠的生存率。LiuZC等將微囊化骨髓干細(xì)胞移植于90﹪肝切除誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠腹腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)微囊內(nèi)的骨髓干細(xì)

6、胞可在腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，并提高急性肝衰竭大鼠的生存率。這些研究說明，骨髓干細(xì)胞可用來治療急性肝衰竭。但目前尚未見肝臟內(nèi)移植骨髓干細(xì)胞治療急性肝衰竭的報(bào)道。骨髓干細(xì)胞包含造血干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，單獨(dú)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植是否亦有助于治療急性肝衰竭亦未見相關(guān)報(bào)道。因此我們設(shè)計(jì)此課題觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞門靜脈移植是否能夠治療大鼠急性肝衰竭。 目的: (1)探索從大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，建立穩(wěn)定的

7、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系，為后續(xù)的干細(xì)胞研究提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型(2)建立大鼠肝切除急性肝衰竭模型，將體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大鼠肝內(nèi)移植，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植是否有助于急性肝衰竭的治療及可能的治療機(jī)制。 方法 (1)利用Percoll密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離有核細(xì)胞，在15﹪胎牛血清，表皮生長因子，白細(xì)胞抑制因子和血小板衍生生長因子的作用下用DMEM/F-12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。繪制細(xì)胞生

8、長曲線，以Patterson公式計(jì)算細(xì)胞在對數(shù)生長期的倍增時(shí)間。用TRAP--銀染法檢測該細(xì)胞系的端粒酶活性，流式細(xì)胞術(shù)測定該細(xì)胞系在反復(fù)傳代后細(xì)胞的表型的穩(wěn)定狀況。 (2)以BrdU標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。建立90﹪肝切除誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型，F(xiàn)-344大鼠隨機(jī)分為二組，A組(實(shí)驗(yàn)組)：90﹪肝切除后經(jīng)門靜脈移植0.5ml骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液(含有1×10<'6>個(gè)細(xì)胞)；B組(對照組)：90﹪肝切除后經(jīng)門靜脈移植0.5ml生理鹽水。觀

9、察術(shù)后二組大鼠的一般情況、血清生化指標(biāo)及生存率，并取實(shí)驗(yàn)組肝組織制備切片，通過免疫組化、免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)觀察受體大鼠肝組織內(nèi)移植細(xì)胞情況。 結(jié)果: (1)剛剛開始貼壁生長的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈規(guī)整的燕麥形，形態(tài)規(guī)整?？寺⌒纬珊髮?shù)生長期大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈梭形或長多邊形，形態(tài)不完全均一，但細(xì)胞排列整齊，邊界清晰，在培養(yǎng)瓶中分布及生長均勻。繪制細(xì)胞生長曲線，Patterson公式計(jì)算骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的倍增時(shí)間為18hr。

10、TRAP-銀染法測定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞端粒酶活性，顯示大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的端粒酶為陽性，表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤細(xì)胞(SKOV3)一致。流式細(xì)胞術(shù)測定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的DNA含量和細(xì)胞周期，分析結(jié)果并與腫瘤細(xì)胞SKOV3進(jìn)行比較?？梢姽撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞100﹪為二倍體，S期細(xì)胞數(shù)量較多(34.72﹪)，而腫瘤細(xì)胞有較高的異倍體率，二倍體細(xì)胞僅為41.97﹪，而且S期細(xì)胞顯著減少(12.1﹪/34.7﹪)。流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表型的鑒定分析顯示骨髓間充質(zhì)干

11、細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90，而CD34、CD45、MHC Ⅰ、MHCⅡ?yàn)殛幮浴?(2)BrdU標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞染色后可見細(xì)胞核內(nèi)有棕褐色陽性反應(yīng)物。臺盼藍(lán)染色測定BrdU標(biāo)記后細(xì)胞活率，可見標(biāo)記后細(xì)胞活率95﹪±0.6﹪。90﹪肝切除后，大鼠于術(shù)后2-4小時(shí)內(nèi)蘇醒，然后逐漸進(jìn)入肝功能衰竭狀態(tài)，表現(xiàn)為拒食，活動明顯減少，毛蓬松。精神萎靡、嗜睡或昏睡，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，尿失禁，尿色深黃。大部分大鼠于術(shù)后3日內(nèi)死亡，7天存

12、活率僅為20﹪。術(shù)后大鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平迅速升高，并于術(shù)后第一天達(dá)到峰值，之后逐漸下降，術(shù)后1、2、3、5天血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶值明顯高于術(shù)前(P<0.05)。術(shù)后第7天時(shí)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶值仍高于術(shù)前，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ALB水平于術(shù)后開始下降，第2天時(shí)達(dá)到最低水平，于第3天開始上升，術(shù)后1、2、3、5天血清白蛋白值明顯低于術(shù)前值(P<0.05)。術(shù)后第7天時(shí)白蛋白值雖仍高于術(shù)前，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯

13、著性差異。肝衰竭大鼠經(jīng)門靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后7天存活率為70﹪，對照組大鼠術(shù)后7天存活率為20﹪，實(shí)驗(yàn)組大鼠存活率明顯高于對照組(p<0.05)。術(shù)后兩組大鼠丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平均升高，白蛋白水平降低。術(shù)后3、5天時(shí)實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)較對照組有所改善，其中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶改善明顯，兩組數(shù)據(jù)比較差異有顯著性(P<0.05)，白蛋白在數(shù)值上雖有改變，但兩組數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P>0.05

14、)。術(shù)后第7天時(shí)兩組各項(xiàng)生化指標(biāo)均接近正常范圍，兩組間數(shù)據(jù)比較無顯著性差異(P>0.05)。免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果顯示BrdU標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后可在肝組織中出現(xiàn)，多分布在匯管區(qū)周圍，細(xì)胞核染成棕褐色，細(xì)胞表現(xiàn)肝細(xì)胞形態(tài)。免疫熒光雙染色，大鼠肝組織切片中見BrdU標(biāo)記細(xì)胞為綠色熒光，白蛋白為紅色熒光，綠色熒光與紅色熒光疊合后呈黃色。黃色細(xì)胞來源于BrdU標(biāo)記并有白蛋白表達(dá)的細(xì)胞。 結(jié)論: (1)利用Percol

15、l密度梯度離心法分離F-344大鼠骨髓有核細(xì)胞，在1.5﹪FCS、EGF、LIF和PDGF的作用下，用：DMEM-LG/F-12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，可獲得穩(wěn)定生長的大鼠MSCs。培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系性狀穩(wěn)定，表型穩(wěn)定均一，是理想的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系，可用于進(jìn)一步的組織工程、細(xì)胞和分子生物學(xué)研究。 (2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)門靜脈移植于急性肝衰竭大鼠體內(nèi)，改善了受損肝臟的功能，顯著提高了急性肝衰竭大鼠的生存率；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可