三羧酸循環(huán)酶CS和SDHB對(duì)卵巢癌生物學(xué)行為mtDNA的作用研究.pdf

1、線粒體是存在于真核細(xì)胞的雙層膜細(xì)胞器，主要功能是進(jìn)行三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化反應(yīng)。幾乎所有的喜氧生物都是以三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化作為產(chǎn)生ATP的主要方式，為細(xì)胞的活動(dòng)提供能量，因此線粒體被稱為“細(xì)胞動(dòng)力工廠”。線粒體基質(zhì)中除包含三羧酸循環(huán)酶系、線粒體基因表達(dá)酶系，還包括線粒體DNA、RNA和核糖體。線粒體是高等動(dòng)物細(xì)胞核外唯一含有DNA的細(xì)胞器，其中包含的人線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是可獨(dú)立于核DNA之

2、外進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的雙鏈閉合環(huán)狀分子。線粒體DNA可編碼13個(gè)與線粒體氧化磷酸化有關(guān)的蛋白。當(dāng)線粒體中三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化通路異常時(shí)，例如三羧酸循環(huán)酶表達(dá)異常時(shí)，線粒體的能量代謝也會(huì)發(fā)生異常，進(jìn)而影響細(xì)胞正常功能的實(shí)現(xiàn)。檸檬酸合成酶（Citrate synthase，CS）和琥珀酸脫氫酶(Succinatedehydrogenase，SDH)是參與三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化的兩個(gè)酶。其中CS是參與三羧酸循環(huán)的限速酶，催化形成產(chǎn)物檸檬酸

3、用于后續(xù)三羧酸循環(huán)，或者轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)用于蛋白質(zhì)乙?；椭舅岽x;SDH是三羧酸循環(huán)中唯一的多亞基線粒體膜結(jié)合酶，包括A、B、C、D四個(gè)亞基，其中SDHB亞基(Succinate dehydrogenasesubunit B)編碼鐵硫蛋白，參與構(gòu)成酶活性區(qū)域，此外SDH還參與線粒體氧化磷酸化呼吸鏈電子傳遞。CS和SDHB均由核基因編碼，參與線粒體能量代謝。目前，CS在惡性腫瘤中的表達(dá)和具體功能有不同的觀點(diǎn)，研究報(bào)道胰腺癌和腎嗜酸細(xì)胞瘤中C

4、S表達(dá)增加，而在多株宮頸癌細(xì)胞株中CS表達(dá)降低;SDH亞基突變能夠引起多種腫瘤，SDH可能是一種腫瘤抑制基因。以上研究提示三羧酸循環(huán)酶在腫瘤發(fā)生中有重要作用。正常狀態(tài)下，線粒體消耗的部分氧氣會(huì)轉(zhuǎn)化為超氧化物陰離子、過(guò)氧化氫和其他過(guò)氧化簇(reactive oxygen species，ROS)。與核DNA相比，由于線粒體DNA中無(wú)內(nèi)含子和保護(hù)性組蛋白，使得mtDNA容易受ROS攻擊，從而使DNA突變或者拷貝數(shù)發(fā)生變化。MtDNA的這種改

5、變會(huì)影響線粒體基因的表達(dá)和一系列線粒體的功能。因此mtDNA的異常改變進(jìn)而會(huì)影響線粒體氧化磷酸化反應(yīng)，甚至導(dǎo)致惡性生長(zhǎng)狀態(tài)。相反的，當(dāng)機(jī)體三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化異常時(shí)，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)代償機(jī)制和應(yīng)急方式維持能量需求，線粒體DNA拷貝數(shù)的增加可能是一種代償機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)線粒體呼吸功能異常。文獻(xiàn)報(bào)道非霍奇金淋巴瘤(NHL)細(xì)胞中線粒體DNA的增加與腫瘤微小殘留病/持續(xù)疾病狀態(tài)(MRD/PD)相關(guān)，NHL化療后存活的殘余細(xì)胞中還檢測(cè)到ATP相關(guān)酶CS的

6、上調(diào)和SDH的下調(diào)，提示CS和SDH與mtDNA的拷貝數(shù)有一定關(guān)系。卵巢癌是常見(jiàn)婦科惡性腫瘤，由于臨床發(fā)現(xiàn)多是晚期而使死亡率較高。目前卵巢癌治療的瓶頸仍是轉(zhuǎn)移和耐藥，尋找卵巢癌轉(zhuǎn)移和耐藥新機(jī)制以及探索治療新靶點(diǎn)仍是重中之重。目前，僅有文獻(xiàn)報(bào)道CS在鼠卵巢癌模型中活性增加，CS和SDHB在人卵巢臨床標(biāo)本的表達(dá)以及與mtDNA拷貝數(shù)的關(guān)系并未進(jìn)行研究。
　　基于上述基礎(chǔ)，本課題針對(duì)CS、SDHB和mtDNA拷貝數(shù)在卵巢癌的表達(dá)進(jìn)行研究

7、，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CS基因沉默抑制卵巢癌細(xì)胞(SKOV3，A2780)增殖、侵襲、遷移能力，增加化療敏感性，降低mtDNA拷貝數(shù);SDHB基因沉默促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞中上述惡性生物學(xué)行為，降低順鉑敏感性，提高mtDNA拷貝數(shù)。
　　本課題分為三個(gè)部分:(1)CS對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究。(2) SDHB對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究。(3) CS和SDHB對(duì)卵巢癌細(xì)胞線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)的作用

8、研究。
　　第一部分檸檬酸合成酶對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究
　　研究目的:
　　研究檸檬酸合成酶(CS)在卵巢腫瘤組織和卵巢細(xì)胞中的表達(dá)水平，探索其對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用和機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.卵巢正常上皮細(xì)胞組織原代培養(yǎng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫蛋白印跡法檢測(cè)人卵巢腫瘤組織和卵巢細(xì)胞中檸檬酸合成酶mRNA和蛋白水平;2.設(shè)計(jì)合成干擾序列基因沉默CS

9、，檢測(cè)CS基因沉默對(duì)細(xì)胞能量水平的影響(ATP、AMPK/P38MAPK);3.檢測(cè)基因沉默CS對(duì)卵巢癌細(xì)胞株增殖、侵襲和遷移的影響（CCK8實(shí)驗(yàn)、Transwell小室）;Western blot檢測(cè)增殖相關(guān)信號(hào)蛋白p-ERK、凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2，cleaved caspase3）及細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白分子(p-FAK，MMP2，Vimentin)的變化;4.檢測(cè)CS基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞耐藥性的影響（轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組IC50值的變化、

10、細(xì)胞凋亡水平、細(xì)胞克隆形成能力）;DNA損傷修復(fù)角度探討CS參與卵巢癌化療耐藥的機(jī)制:Western blot檢測(cè)基因沉默前后卵巢癌細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)能力的變化(ERCC1，γ-H2AX);5.基因芯片技術(shù)檢測(cè)CS基因沉默前后基因水平變化，real-time PCR驗(yàn)證與耐藥、凋亡和自噬相關(guān)基因(CASP7，IRF7，DDX58，ISG15，ATG12）的水平變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.卵巢癌組織中檸檬酸合成酶表達(dá)水平

11、較卵巢良性腫瘤組織高，卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和A2780中CS水平較卵巢正常上皮細(xì)胞(HOSE)高;2.CS基因沉默前后細(xì)胞中ATP變化不明顯（P＞0.05），而AMPK/P38 MAPK顯著受抑制(P＜0.05);3.CS基因沉默降低卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和A2780細(xì)胞增殖速度（P＜0.05），促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P＜0.05），同時(shí)顯著抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力(P＜0.05);4.基因沉默CS明顯降低了卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的24小時(shí)半數(shù)抑制

12、濃度IC50值(P＜0.05)，細(xì)胞凋亡水平增加，化療藥物順鉑處理后卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成能力降低(P＜0.05);同時(shí)發(fā)現(xiàn)基因沉默CS后，細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力降低（ERCC1降低），DNA損傷增加(γ-H2AX增加);5.CS基因沉默明顯增加CASP7，IRF7，DDX58，ISG15基因水平(P＜0.05)，而ATG12水平降低，但不顯著(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　CS在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，基因沉

13、默CS能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖活性，顯著降低卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，也可以增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。CS通過(guò)影響ERK信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡影響卵巢癌細(xì)胞的增殖活性，通過(guò)影響MMP2，p-FAK和Vimentin蛋白分子影響卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。CS沉默通過(guò)降低癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力、增加DNA損傷提高卵巢癌細(xì)胞的化療敏感性。
　　第二部分琥珀酸脫氫酶B亞基對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究

14、　　研究目的:
　　研究琥珀酸脫氫酶B亞基(SDHB)在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)水平。探索SDHB對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的影響，并進(jìn)一步研究其中的相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.Real-time PCR和Westem blot檢測(cè)SDHB在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)水平;2.Western blot檢測(cè)不同卵巢癌細(xì)胞株中SDHB蛋白水平;3.SKOV3和A2780細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶

15、B亞基基因沉默，檢測(cè)基因沉默對(duì)細(xì)胞能量水平的影響（ATP、AMPK/P38MAPK）;4.檢測(cè)基因沉默SDHB對(duì)卵巢癌細(xì)胞株增殖、侵襲和遷移的影響（CCK8實(shí)驗(yàn)，Transwell小室）;Western blot檢測(cè)增殖相關(guān)信號(hào)蛋白p-ERK、凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2，cleaved caspase3)及細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白分子(p-FAK，MMP2)的變化;5.觀察基因沉默SDHB對(duì)卵巢癌細(xì)胞耐藥性的影響（轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組IC50值的變化、

16、細(xì)胞凋亡水平、細(xì)胞克隆形成能力）;DNA損傷修復(fù)角度探討SDHB參與卵巢癌化療耐藥的機(jī)制:通過(guò)Western blot檢測(cè)基因沉默前后卵巢癌細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)能力的變化（ERCC1，γ-H2AX）;6.構(gòu)建SDHB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞進(jìn)行功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)（增殖、侵襲、遷移和化療敏感性相關(guān)實(shí)驗(yàn)）;7.從缺氧角度研究SDHB對(duì)卵巢癌影響的機(jī)制:檢測(cè)SDHB基因沉默和過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α水平的影響;氯化鈷誘導(dǎo)HIF-1

17、α表達(dá)，檢測(cè)SDHB與HIF-1α表達(dá)水平的關(guān)系。
　　研究結(jié)果:
　　1.SDHB在卵巢癌組織中表達(dá)低于正常卵巢組織(P＜0.05)，而且mRNA水平在卵巢癌轉(zhuǎn)移灶低于原發(fā)灶(P＜0.05);2.不同卵巢癌細(xì)胞株中SDHB表達(dá)水平不同;3.SKOV3和A2780細(xì)胞中SDHB基因沉默降低細(xì)胞中ATP水平，AMPK/P38 MAPK上調(diào);4.SDHB基因沉默增加細(xì)胞增殖速度，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移能力;5.隨順鉑濃度增加，

18、卵巢癌細(xì)胞中SDHB水平逐漸升高;基因沉默SDHB明顯增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值(P＜0.05)、減低細(xì)胞凋亡水平，增強(qiáng)細(xì)胞的克隆形成能力(P＜0.05);基因沉默SDHB后，細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力增加，DNA損傷降低;6.過(guò)表達(dá)SDHB后，SKOV3細(xì)胞惡性生物學(xué)行為（增殖、侵襲、遷移、化療敏感性）部分逆轉(zhuǎn);7.SDHB基因沉默增加HIF-1α表達(dá)，過(guò)表達(dá)SDHB降低HIF-1α表達(dá)，隨HIF-1α表達(dá)增加SDHB水平降低。.<

19、br>　　結(jié)論:
　　SDHB在卵巢癌組織低表達(dá)，尤其轉(zhuǎn)移灶中更低?；虺聊琒DHB能夠增加卵巢癌細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，也可以降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，而SDHB過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)上述惡性生物學(xué)行為。SDHB是通過(guò)影響HIF-1α表達(dá)而影響卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，通過(guò)影響DNA損傷水平影響化療敏感性。
　　第三部分檸檬酸合成酶和琥珀酸脫氫酶B亞基對(duì)卵巢癌細(xì)胞線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)的作用研究

20、　　研究目的:
　　研究線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)（mtND2/HBB）和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)在卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤中的水平，探索CS和SDHB對(duì)線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)的影響和相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.Real-time PCR檢測(cè)卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織中線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A水平;2.Real-time PCR檢測(cè)卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織中CS和SDHB基因水平;3.SK

21、OV3和A2780細(xì)胞株分別基因沉默CS和SDHB，real-time PCR檢測(cè)基因沉默前后mtND2/HBB和TFAM的表達(dá)水平;4.從線粒體DNA生成角度分別探索CS和SDHB對(duì)線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)的影響:Western blot檢測(cè)ERK/P38 MAPK水平，real-time PCR檢測(cè)基因沉默前后線粒體DNA合成相關(guān)因子PGC-1α水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.卵巢癌組織中線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)和TFAM顯

22、著高于卵巢良性腫瘤組織（P＜0.05）;2.卵巢癌組織中CS基因水平顯著高于卵巢良性腫瘤組織(P＜0.01)，而SDHB基因水平卵巢癌組織顯著低于卵巢良性腫瘤組織(P＜0.05);3.CS基因沉默降低顯著卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780中mtND2/HBB水平(P＜0.05)，TFAM水平也降低但是不顯著（P＞0.05）;SDHB基因沉默顯著增加卵巢癌細(xì)胞中mtND2/HBB水平(P＜0.05)，而TFAM水平增加不顯著（P＞0.05）

23、;4.CS基因沉默后SKOV3和A2780兩株細(xì)胞中ERK和P38磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)，同時(shí)PGC-1α基因水平降低但不顯著(P＞0.05); SDHB基因沉默后兩株細(xì)胞中ERK和P38磷酸化水平顯著上調(diào)（P＜0.05），PGC-1α基因水平上調(diào)不顯著(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　卵巢癌組織中線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)和TFAM水平均高于卵巢良性腫瘤組織，CS和SDHB表達(dá)水平影響卵巢癌細(xì)胞株線粒體相對(duì)拷貝數(shù)