RNA適體與代謝小分子相互作用的研究.pdf

1、核酸適體（Nucleic acid aptamer）是一類經(jīng)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）從體外人工合成的單鏈核酸文庫中篩選出的核酸小分子，分為DNA適體和RNA適體。其中RNA適體因其二級結(jié)構(gòu)的多樣性而具有靶分子廣、親和力高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，而且易改造修飾、制備方便，在基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物研制等方面展現(xiàn)了廣闊的

2、應(yīng)用前景。本論文以精氨酸為研究對象通過SELEX篩選技術(shù)獲得了特異性結(jié)合精氨酸的RNA適體，并對其生物活性進(jìn)行了評價(jià)。
　　本實(shí)驗(yàn)中，我們通過體外合成的方式構(gòu)建了單鏈DNA文庫，總長度100個核苷酸，由兩端37個固定接頭序列和中間63個隨機(jī)序列構(gòu)成；利用PCR技術(shù)對DNA文庫進(jìn)行雙鏈擴(kuò)增，再通過體外轉(zhuǎn)錄的方式獲得篩選的起始材料——單鏈RNA文庫。RNA文庫中含有63個隨機(jī)排布的核苷酸，4種堿基分布均勻，幾乎囊括了所有隨機(jī)組合的可能

3、性。
　　我們選擇代謝小分子精氨酸作為研究對象，利用共價(jià)耦聯(lián)瓊脂糖珠子的精氨酸作為固定相，對單鏈RNA文庫進(jìn)行體外篩選；對篩選獲得的RNA序列進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、體外擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄，形成次一級核酸文庫，利用生成的次一級核酸文庫重復(fù)篩選過程；直到獲得與靶分子精氨酸親和力較高的RNA適體。在篩選過程中，通過調(diào)節(jié)PCR循環(huán)數(shù)提高了生成目標(biāo)產(chǎn)物的效率；通過在T7啟動子前添加一段調(diào)節(jié)序列，解決了隨機(jī)文庫轉(zhuǎn)錄效率低的困難。經(jīng)過了22輪的體外篩選，我們獲得

4、了在測序過程中出現(xiàn)頻率最高的一段RNA序列（命名為22-7），該序列在100個測序的克隆中重復(fù)出現(xiàn)了6次，在第20輪測序中的100個克隆中重復(fù)出現(xiàn)了5次。體外轉(zhuǎn)錄合成了該序列并利用ITC分析，發(fā)現(xiàn)該序利與游離的精氨酸有較高的親和力。
　　為了研究該適體是否能夠在原核生物體內(nèi)發(fā)揮功能，我們首先利用 BLAST分析了22-7與大腸桿菌RNA的序列同源性，結(jié)果表明同源性不存在，然后我們將RNA適體22-7通過添加內(nèi)源小RNA的轉(zhuǎn)錄元件，

5、構(gòu)建了其在大腸桿菌中的過表達(dá)體系。選取大腸桿菌精氨酸分解代謝AST途徑中的兩個基因——精氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（astA）和琥珀酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（astC）為研究對象，對RNA適體體內(nèi)生物活性進(jìn)行評價(jià)。實(shí)驗(yàn)證明，RNA適體22-7過表達(dá)之后，astA和astC表達(dá)水平明顯受到抑制。由此說明，RNA適體22-7在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)后，對精氨酸代謝相關(guān)基因起到了調(diào)控的作用。
　　細(xì)菌小RNA（sRNA）是一類長度在50~500nt的調(diào)控RN

6、A，它能通過與靶標(biāo)mRNA以不完全配對方式結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控作用，那么sRNA是否具有適體結(jié)合代謝小分子的功能呢？通過比較我們選取了與糖代謝相關(guān)的SgrS進(jìn)行驗(yàn)證，SgrS是葡萄糖壓力相關(guān)的sRNA，當(dāng)葡萄糖壓力增大時，SgrS能阻止葡萄糖分子的跨膜運(yùn)輸。我們首先構(gòu)建了SgrS過表達(dá)體系，檢測在有或無葡萄糖刺激的情況下，其靶基因ptsG的表達(dá)水平是否發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，SgrS對其靶基因ptsG表達(dá)水平的影響不依賴于葡萄糖。