miR-16-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和凋亡的影響.pdf

1、為了探究miR-16-5p在乳腺癌中的表達(dá)及作用，筆者進(jìn)行以下幾個(gè)方面的研究:一、乳腺癌組織中miR-16-5p、HIF-1α、VEGF的表達(dá)及其與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系;二、上調(diào)miR-16-5p的表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;三、miR-16-5p對(duì)HIF-1α、VEGF轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用機(jī)制研究。
　　第一部分 乳腺癌組織中miR-16-5p、HIF-1α、VEGF的表達(dá)及其與患者臨

2、床病理學(xué)特征的關(guān)系
　　方法:
　　1.采集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科74例手術(shù)切除乳腺癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常乳腺組織標(biāo)本。
　　2.采用Agilent miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)3例乳腺癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常乳腺組織標(biāo)本中miRNA的表達(dá)情況。
　　3.運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)74例樣本中miR-16-5p和HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)。
　　4.采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)HIF-1α

3、和VEGF的蛋白表達(dá)情況。
　　5.分析miR-16-5p、HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)與乳腺癌患者性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。
　　6.采用SPSS21.0.軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)Agilent miRNA芯片檢測(cè)分析，在乳腺癌組織中共有86個(gè)miRNAs表達(dá)異常，其中46個(gè)上調(diào)，40個(gè)下調(diào)。miR-16-5p在乳腺非特殊型浸

4、潤(rùn)性癌中呈高表達(dá)。
　　2.qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-16-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)較正常乳腺組織顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示，HIF-1α、VEGF在乳腺癌組織中的mRNA水平表達(dá)量均顯著高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，HIF-1α、VEGF在乳腺癌組織中的蛋白水平表達(dá)量均顯著高于癌旁正常組織，差

5、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.乳腺癌組織中miR-16-5p以及HIF-1α與VEGF的mRNA表達(dá)水平與患者的組織學(xué)分級(jí)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P均＜0.05）;
　　結(jié)論:
　　1.在乳腺癌組織中，miR-16-5p表達(dá)水平較正常乳腺組織顯著降低，提示其可能在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。
　　2.miR-16-5p可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，且可能與HIF-1α和VEGF的表達(dá)密切相

6、關(guān)。
　　第二部分 上調(diào)miR-16-5p的表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)作用的影響
　　方法:
　　1.采用Real-time PCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中miR-16-5p在不同乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435，MDA-MB-468，T47D以及正常乳腺細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)。
　　2.慢病毒感染MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，篩選得到穩(wěn)定表

7、達(dá)miR-16-5p的細(xì)胞株，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)慢病毒感染后MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中miR-16-5p的表達(dá)。
　　3.本實(shí)驗(yàn)分為三組:實(shí)驗(yàn)組（重組miR-16-5p慢病毒感染細(xì)胞），空白組（未處理的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞）和陰性對(duì)照組（miR-NC慢病毒感染細(xì)胞）。
　　4.本課題采用CCK-8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)各組細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)能力進(jìn)行檢測(cè)。
　　5.AnnexinⅤ-APC/P

8、I雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst染色法對(duì)各組細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。采用侵襲實(shí)驗(yàn)對(duì)各組細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行檢測(cè)。
　　6.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-16-5p過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤的影響，并采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.miR-16-5p在MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,MDA-MB-468,T47D乳腺癌細(xì)

9、胞株中mRNA水平較MCF-10A的表達(dá)均有所下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中以MCF-7和MDA-MB-231下降最為顯著。
　　2.成功構(gòu)建含miR-16-5p序列的慢病毒載體，穩(wěn)定高表達(dá)組中LV1-miR-16-5p在MCF-7中的表達(dá)量約為空白細(xì)胞組的6.41倍，在MDA-MB-231中的表達(dá)量約為空白細(xì)胞組的4.56倍。
　　3.通過(guò)CCK-8法檢測(cè)，結(jié)果表明miR-16-5p組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照

10、組相比，吸光度減少顯著。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-16-5p組細(xì)胞克隆形成數(shù)較無(wú)關(guān)對(duì)照組和空白對(duì)照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.AnnexinⅤ-APC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst染色檢測(cè)顯示重組miR-16-5p慢病毒感染后MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率較空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組顯著升高。
　　5.侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MCF-7實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)為（49.0±5.1）個(gè)，相比

11、于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。MDA-MB-231實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)為（42.0±7.1）個(gè)，與空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)對(duì)照組相比顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織體積和正常對(duì)照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。瘤組織免疫組化結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Hif和VEGF表達(dá)較正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯減少。
　　結(jié)論:
　　

12、1.成功建立了過(guò)表達(dá)miR-16-5p的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株。
　　2.體外上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中miR-16-5p表達(dá)可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、降低其侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明miR-16-5p過(guò)表達(dá)能有效抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)。
　　第三部分 miR-16-5p對(duì)HIF-1α、VEGF轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用機(jī)制的初步研究
　　方法:
　　1.通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-16-5p的下游靶基

13、因。
　　2.設(shè)計(jì)靶向HIF-1α和VEGF的siRNA序列，轉(zhuǎn)染至MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞。分為以下幾組:未轉(zhuǎn)染的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞（Blank組）、miR-16-5p慢病毒感染的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞（miR-16-5p組）、HIF-1αsiRNA干擾表達(dá)的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞以及VEGF siRNA干擾表達(dá)的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞。通過(guò)qRT-PCR、

14、Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Hif/VEGF mRNA和蛋白表達(dá)，CCK-8法檢測(cè)各組之間細(xì)胞增殖，AnnexinⅤ-APC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組之間的凋亡情況，侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組之間的侵襲能力。通過(guò)western blot的方法檢測(cè)不同HIF-1α和VEGF以及miR-16-5p表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖，凋亡以及侵襲等相關(guān)蛋白的影響。
　　3.構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3.1-HIF-1α、pcDNA3.1-VEGF，通

15、過(guò)回復(fù)實(shí)驗(yàn)分析miR-16-5p對(duì)HIF-1α和VEGF生物學(xué)活性的調(diào)控。
　　結(jié)果:
　　1.HIF-1α和VEGF是miR-16-5p的預(yù)測(cè)靶基因。
　　2.MiR-16-5p不改變HIF-1α和VEGF的轉(zhuǎn)錄水平，但顯著影響其蛋白的水平，但siRNA干擾后，其HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。
　　3.HIF-1α和VEGF的過(guò)表達(dá)明顯恢復(fù)miR-16-5p過(guò)表達(dá)細(xì)胞系MCF-7和MDA-

16、MB-231中HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)。
　　4.HIF-1α和VEGF過(guò)表達(dá)能夠明顯逆轉(zhuǎn)miR-16-5p過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的促凋亡情況。
　　5.HIF-1α和VEGF過(guò)表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的侵襲能力顯著增高，且能夠明顯逆轉(zhuǎn)miR-16-5p過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌侵襲能力的抑制作用。
　　6.miR-16-5p的過(guò)表達(dá)與HIF-1α和VEGF的沉默能

17、協(xié)同性降低細(xì)胞的侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，同時(shí)轉(zhuǎn)染后，BAD，BAX，和cleaved caspase3的表達(dá)顯著上升，MMP-9，p-AKT以及HIF-1α的表達(dá)均顯著降低。
　　結(jié)論:
　　1.miR-16-5p通過(guò)HIF-1α和VEGF發(fā)揮抑制乳腺癌的作用。
　　2.操縱miR-16-5p可能成為未來(lái)乳腺癌潛在的分子治療靶點(diǎn)。
　　全文結(jié)論:
　　1.乳腺癌組織中，miR-16-5p表達(dá)水平較正常組織