TAT介導(dǎo)EGFP在小鼠體內(nèi)的分布及介導(dǎo)BDNF治療PD模型鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文TAT介導(dǎo)EGFP在小鼠體內(nèi)的分布及介導(dǎo)BDNF治療PD模型鼠的實(shí)驗(yàn)研究姓名：王海珍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：張?jiān)茲h許予明200705012007屆博士研究生畢業(yè)論文TAT介導(dǎo)EGFP在小鼠體內(nèi)的分布及介導(dǎo)BDNF治療PD模型鼠的試驗(yàn)研究導(dǎo)到組織及細(xì)胞內(nèi)，甚至透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。國(guó)外已有學(xué)者將TAT與相對(duì)分子質(zhì)量為(15～200)X103的蛋白進(jìn)行融合后，介導(dǎo)這些蛋白從細(xì)胞外到細(xì)胞

2、內(nèi)的直接跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。還有報(bào)道提到TAT與銅鋅超氧化物歧化酶的融合蛋白跨膜進(jìn)入胰島B細(xì)胞可以達(dá)到治療I型糖尿病的目的。將TAT與P53和P27等腫瘤抑制蛋白輸入含有腹膜腫瘤的小鼠模型，可以延長(zhǎng)小鼠的壽命。TAT的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用具有速度快，不依賴于溫度、能量、細(xì)胞膜抗體，而且對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損傷等特點(diǎn)，因此被認(rèn)為是一種很有前途的運(yùn)載工具；目前有關(guān)TAT融合蛋白的神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)用多集中在對(duì)腦缺血疾病的研究中，對(duì)于TAT融合腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療帕金森病的研究，

3、國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題首先利用增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentproteinEGFP)作為標(biāo)記蛋白，構(gòu)建TAT—EGFP重組載體并表達(dá)融和蛋白，靜脈注射小鼠后觀察融和蛋白進(jìn)入體內(nèi)各組織的情況，以證實(shí)TAT的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，尤其是穿透血腦屏障進(jìn)入腦組織的能力，為T(mén)AT攜帶藥物治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論基礎(chǔ)。隨后構(gòu)建TAT—BDNF重組載體并表達(dá)融和蛋白，經(jīng)過(guò)在體外與多巴胺能神經(jīng)元作用檢測(cè)其生物學(xué)活性后，

4、靜脈注入PD大鼠模型，來(lái)觀察TAT—BDNF對(duì)模型鼠的治療作用，以期找到一種能靜脈應(yīng)用且能夠穿透血腦屏障有效治療PD的方法。本研究分為以下三個(gè)部分：第一部分TAT介導(dǎo)EGFP在小鼠體內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方法：1以pEGFPN3為模版，通過(guò)PCR及基因克隆技術(shù)，構(gòu)建表達(dá)載體pEGFP。2人工合成編碼TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的兩條DNA片段，退火后得到雙鏈。雙鏈經(jīng)過(guò)酶切及與pEGFP連接后，構(gòu)建表達(dá)載體p1AT—EGFP。利用雙酶切及基因測(cè)序來(lái)鑒定載體。3