ILYd4蛋白的制備及在抗體介導(dǎo)腫瘤免疫治療的實(shí)驗(yàn).pdf

1、單克隆抗體是針對腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的免疫治療藥物，其特異性強(qiáng)，毒副作用小，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同治療效應(yīng)的優(yōu)勢?，F(xiàn)已有數(shù)種治療腫瘤的單克抗體在臨床上應(yīng)用，如美羅華(rituximab)治療非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，赫賽汀(Herceptin)治療HER2陽性的乳腺癌，愛必妥(Cetuximab)治療結(jié)腸癌，取得了良好的治療效應(yīng)，同時一些新的單克隆抗體正逐步被開發(fā)出來，已開始應(yīng)用在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究甚至臨

2、床前期試驗(yàn)。所有的這些都為單克隆抗體治療腫瘤的臨床應(yīng)用展現(xiàn)出美好的前景。但不幸的是原發(fā)的耐藥或繼發(fā)性的耐藥不可避免的發(fā)生了。如何克服這些耐藥問題已成為擺在人們面前的挑戰(zhàn)之一。單克隆抗體治療腫瘤的機(jī)制主要為CDC(complementdependent cytotoxicity補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性作用)，ADCC(antibody dependentcell-mediated cytotoxicity抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用)和直接

3、凋亡(apoptosis)作用，以及利用信號傳導(dǎo)抑制腫瘤細(xì)胞的生長。其中補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性作用(CDC)是單克隆抗體殺傷腫瘤細(xì)胞的主要作用機(jī)制之一。而影響補(bǔ)體激活效應(yīng)的補(bǔ)體抑制蛋白在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，其中又以抑制補(bǔ)體激活終末產(chǎn)物MAC(膜攻擊復(fù)合物membrane attack complex)形成的CD59最為重要。利用抗體，siRNA，多肽等多種方法干擾CD59的產(chǎn)生和廢除其功能，有效增強(qiáng)了抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體殺傷腫瘤效應(yīng)。

4、但因CD59抗原同樣表達(dá)在人體正常的組織細(xì)胞，所以這些方法可對正常人體細(xì)胞產(chǎn)生損傷，且應(yīng)用效率較差，限制了其在臨床上的應(yīng)用價值。ILY毒素(intermedilysin)是一種由革蘭氏陽性的病原菌中間型葡萄球菌S.intermedius分泌出來細(xì)胞穿孔毒素，其第四個功能部可特異性的與人類CD59抗原結(jié)合。哈佛醫(yī)學(xué)院Translational Research Lab實(shí)驗(yàn)室用基因工程技術(shù)構(gòu)建了含ILYd4基因片段的質(zhì)粒，本課題就是利用這個

5、質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的BL2大腸桿細(xì)胞，表達(dá)純化重組的ILYd4蛋白，并鑒定其純度及生物學(xué)活性。然后觀察其在改善抗CD20抗原的單克隆抗體Rituximab介導(dǎo)的對人類小囊泡淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞系RL-7，誘導(dǎo)耐藥的人類伯基特淋巴瘤細(xì)胞系RR51.2及藥物抵抗的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系A(chǔ)RH-77的補(bǔ)體殺傷效應(yīng)中的作用。我們還將從小鼠腹腔中提取外周巨噬細(xì)胞觀察重組ILYd4蛋白是否有助于其介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)也在實(shí)體瘤骨肉瘤的SAOS2細(xì)胞

6、系中進(jìn)行。另外，我們也觀察在耐藥的RR51.2細(xì)胞載瘤裸鼠體內(nèi)rILYd4蛋白是否可有效的改善rituximab的治療效應(yīng)。
　　 第一部分重組ILYd4蛋白的表達(dá)，提取，純化和生物活性鑒定
　　 背景：ILY(intermedilysin)是一種穿孔毒素，它特異性結(jié)合人類CD59抗原，結(jié)合位點(diǎn)是其第四個功能部。如何能利用它特異性結(jié)合人類CD59抗原的功能，而去除其穿孔毒性的特性，制造出有效結(jié)合CD59抗原而無毒性的特異

7、性蛋白。哈佛醫(yī)學(xué)院Translational Research Lab實(shí)驗(yàn)室利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了含ILYd4基因序列的質(zhì)粒載體。我們利用它來表達(dá)重組的ILYd4蛋白，并鑒定它的生物學(xué)活性，看它是否能有效的結(jié)合人類CD59抗原并表達(dá)一定的生物學(xué)活性。
　　 方法：含ILYd4基因序列的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的BL2大腸桿菌細(xì)胞，擴(kuò)增，表達(dá)重組的ILYd4蛋白。His-binding技術(shù)純化蛋白。SDS-PAGE鑒定其純度及分子量。F

8、ACS分析其能否有效的結(jié)合人類紅細(xì)胞的CD59抗原。溶血試驗(yàn)鑒定其生物學(xué)活性。同法提取含部分ILYd4基因的重組ILY3蛋白，研究是否同樣有生物學(xué)活性。
　　 結(jié)論：利用基因工程技術(shù)可成功的表達(dá)，提取，純化重組的ILYd4蛋白，其具有較好的純度及良好的結(jié)合人類CD59抗原廢除其功能的生物學(xué)活性。
　　 第二部分：重組ILYd4蛋白改善Rituximab對人類小囊泡淋巴瘤細(xì)胞系RL-7，誘導(dǎo)耐藥的人類伯基特淋巴瘤細(xì)胞系RR

9、51.2及多發(fā)性骨髓瘤ARH-77細(xì)胞系的免疫治療作用的實(shí)驗(yàn)。
　　 背景：Rituximab是一種特異性的結(jié)合人類CD20抗原的單克隆抗體。其已在臨床治療上得到有效的應(yīng)用，但不可避免的產(chǎn)生原發(fā)的或繼發(fā)的耐藥。研究表明CD59抗原高表達(dá)，是限制單克隆抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性的主要因素之一。廢除CD59功能，從而增強(qiáng)Rituximab的治療效應(yīng)是當(dāng)前研究的重要課題。我們提取純化了重組ILYd4蛋白，它可有效的結(jié)合人類的CD59

10、抗原，且具有良好的生物學(xué)活性。我們嘗試?yán)胷ILYd4蛋白結(jié)合人類小囊泡淋巴瘤細(xì)胞系RL-7，誘導(dǎo)耐藥的人類伯基特淋巴瘤細(xì)胞系RR51.2及耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞ARH-77上的CD59抗原。觀察是否有利于增強(qiáng)rituxiamb的治療效果及逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性。
　　 方法：對敏感的人類伯基特淋巴瘤OR細(xì)胞(Ramos cells)給予逐漸加量的rituximab及10％正常成人血漿誘導(dǎo)，逐漸生成對rituximab抵抗的RR51.

11、2細(xì)胞系。FACS分析檢測其表面mCRPs(membrane complement regulated proteins膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白)及CD20的表達(dá)，Western blot檢測CD59蛋白質(zhì)量，RT-PCR檢測CD59的mRNA的表達(dá)水平。CDC效應(yīng)試驗(yàn)比較它們對rituximab的敏感性。在rituximab介導(dǎo)的對RL-7，RR51.2和ARH-77細(xì)胞的CDC效應(yīng)試驗(yàn)中逐漸增加rILYd4的用量，來觀察其增強(qiáng)rituxima

12、b作用效果的情況。同樣用飽和劑量的rILYd4去中和這些細(xì)胞表面的CD59抗原后，觀察其耐藥性的逆轉(zhuǎn)情況。從小鼠的腹腔中提取了外周的巨噬細(xì)胞，檢測rILYd4及rituximab在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)中的作用。分析不同細(xì)胞系的CD20和mCRPs的表達(dá)和rituximab，rILYd4的用量。觀察在有效的rituximab治療的情況下，rILYd4的IC50(50％細(xì)胞死亡時的劑量)及其和CD59表達(dá)量的關(guān)系。同時進(jìn)行了rILYd

13、4的腫瘤細(xì)胞毒性試驗(yàn)。
　　 結(jié)論：Rituximab誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞耐藥是篩選了CD59高表達(dá)的細(xì)胞亞群。rILYd4通過增強(qiáng)CDC效應(yīng)來致敏淋巴瘤細(xì)胞系RL-7和RR51.2以及ARH-77細(xì)胞系并逆轉(zhuǎn)其耐藥性，而這和腫瘤細(xì)胞的CD59表達(dá)量有關(guān)系。rILYd4蛋白本身并無細(xì)胞毒性效應(yīng)。
　　 第三部分：重組ILYd4蛋白在體外致敏抗CD24單克隆抗體介導(dǎo)的抗骨肉瘤細(xì)胞系SAOS2的CDC效應(yīng)的試驗(yàn)。
　　 背

14、景：我們已經(jīng)證實(shí)了重組ILYd4蛋白通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的CD59抗原，增強(qiáng)了rituximab在血液系統(tǒng)腫瘤治療中介導(dǎo)的CDC效應(yīng)。同樣CD59抗原的高表達(dá)，也是實(shí)體瘤抵抗單克隆抗體治療的因素之一。實(shí)體瘤骨肉瘤細(xì)胞系SAOS2有高的CD59和CD24表達(dá)，抗CD24單克隆抗體SN3可有效的激活補(bǔ)體系統(tǒng)。我們觀察重組ILYd4蛋白可否有效的提高抗CD24單克隆抗體在SAOS2細(xì)胞中的治療效應(yīng)。
　　 方法：我們用Trypan b

15、lue和Alarma blue法來檢測rILYd4在提高抗CD24單克隆抗體(SN3)治療SAOS2細(xì)胞系中的效應(yīng)以及當(dāng)飽和劑量的rILYd4中和情況下，SAOS2細(xì)胞的致敏情況。外周巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)也同時被檢測。
　　 第四部分：重組ILYd4蛋白增強(qiáng)Rituximab對RR51.2耐藥淋巴瘤的載瘤裸鼠治療效應(yīng)試驗(yàn)
　　 背景：在體外我們已經(jīng)證實(shí)了重組ILYd4蛋白可有效的提高單克隆抗體治療耐藥腫瘤細(xì)胞系的效

16、果。但其在體內(nèi)的效果仍然未被證實(shí)。為了驗(yàn)證其在載瘤動物體內(nèi)的治療效果，我們將聯(lián)合應(yīng)用rituximab和rILYd4對RR51.2耐藥淋巴瘤的載瘤裸鼠進(jìn)行治療，了解rituximab和rILYd4的聯(lián)合治療效應(yīng)。
　　 方法：培養(yǎng)RR51.2誘導(dǎo)耐藥的淋巴瘤細(xì)胞系，濃縮后接種于裸鼠背部。接種成功后，載瘤裸鼠分成五個不同的治療組。PBS空白對照組，單獨(dú)rILYd4注射組，Rituximab單獨(dú)注射組，Rituximab+rILYd