小白菊內(nèi)酯對(duì)人食管癌細(xì)胞EC9706的增殖和凋亡的影響.pdf

1、背景和目的
　　 食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。由于食管癌進(jìn)展快,易發(fā)生浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,加上術(shù)后化療藥物副作用大,腫瘤對(duì)化療藥物易產(chǎn)生抵抗性,因此,多數(shù)食管癌患者預(yù)后不佳。尋找安全、副作用小、對(duì)腫瘤特異的有效抗腫瘤藥物是醫(yī)學(xué)界的重大課題。
　　 核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor kappaB,NF-κB)是由Sen和Baltimore在二十多年前發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)。它可以激活與腫

2、瘤增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和凋亡有關(guān)的重要基因的表達(dá),大量的研究表明,食管癌中有NF-κB的持續(xù)性表達(dá),它與食管癌的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和抗凋亡密切相關(guān)。
　　 小白菊內(nèi)酯(parthenolide,PN)是墨西哥印第安藥用植物小白菊的化學(xué)成分,具有抗炎作用。最近發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤都有抑制作用；與化療藥物聯(lián)合使用可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,而對(duì)正常細(xì)胞無殺傷作用。據(jù)報(bào)道,PN是NF-κB的有效抑制劑,通過抑制NF-κB的活化,抑制腫瘤

3、細(xì)胞的增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 目前,小白菊內(nèi)酯對(duì)食管癌的研究報(bào)道極少,本實(shí)驗(yàn)以人食管癌細(xì)胞株EC9706為研究對(duì)象,研究PN對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響,探討PN抗腫瘤的機(jī)制。
　　 材料與方法
　　 1.標(biāo)本:人食管癌細(xì)胞EC9706由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所王明榮教授惠贈(zèng),河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存。經(jīng)復(fù)蘇孵育,傳代培養(yǎng),分為不同的實(shí)驗(yàn)組。
　　 2.倒置顯微鏡觀察不同濃度PN作用EC97

4、06細(xì)胞24h、48h、72h后形態(tài)學(xué)變化。
　　 3.采用MTT法檢測(cè)不同濃度PN及PN與5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)聯(lián)合作用EC9706細(xì)胞24h、48h、72h后,細(xì)胞增殖活性的變化。
　　 4.采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子(vescular endothelium growth factor,VEGF)、NF-κBp65蛋白和Ki-67抗原表達(dá)。

5、>　　 5.采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞中NF-κBp65mRNA表達(dá)。
　　 6.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞的凋亡變化情況。
　　 7.采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析；兩組以上均數(shù)的比較用單因素方差分析；以α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.在倒置顯微鏡下,食管

6、癌細(xì)胞EC9706呈多邊形,對(duì)數(shù)生長期的EC9706常融合成片,細(xì)胞連接緊密。實(shí)驗(yàn)組EC9706細(xì)胞與對(duì)照組相比,細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞連接消失,高濃度PN作用后所有細(xì)胞固縮變圓,核濃縮、核漿分布不清,細(xì)胞溶解碎裂。溶劑對(duì)照組未出現(xiàn)上述變化。
　　 2.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:20μmol/L的PN對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖有抑制作用,抑制率為8.64％。不同濃度的PN(20-100μmol/L)、5-FU(25μg/mL和50μg/mL)及

7、PN(20μmol/L)與5-FU(25μg/mL)聯(lián)合作用于EC9706細(xì)胞24h、48h和72h后均不同程度的抑制細(xì)胞增殖。同一時(shí)間段內(nèi)不同濃度組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=203.392,P<0.05),相同的濃度不同作用時(shí)間組的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=401.093,P<0.05),時(shí)間組和濃度組間有交互作用(F=15.604,P<0.05)。PN100μmol/L24h的抑制率為39.39％,48h為48.03％,72h時(shí)間

8、段PN40μmol/L和50μmol/L組的抑制率達(dá)45.56％和50.05％。溶劑對(duì)照組的抑制率在2.67％-5.59％之間,與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合組24h的抑制率(66.53％)與5-FU50μg/mL作用48h的抑制率(64.07％)相當(dāng)；聯(lián)合組48h的抑制率(92.37％)與5-FU50μg/mL作用72h的抑制率(93.16％)相當(dāng)。
　　 3.細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果:食管癌EC9706細(xì)胞高

9、表達(dá)VEGF、NF-κBp65蛋白和Ki-67抗原。不同濃度的PN(20-50μmol/L)、5-FU(25μg/mL)及PN(20μmol/L)與5-FU(25μg/mL)聯(lián)合作用EC9706細(xì)胞24h、48h和72h后VEGF、NF-κBp65蛋白和Ki-67抗原表達(dá)逐漸降低,三個(gè)時(shí)間段不同濃度組間的比較及相同濃度不同作用時(shí)間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PN抑制EC9706細(xì)胞中VEGF、NF-κBp65蛋白和Ki-67

10、抗原表達(dá)具有時(shí)間和劑量依賴性。5-FU(25μg/mL)組中NF-κBp65蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較略有升高。與5-FU(25μg/mL)組相比,聯(lián)合組中EC9706細(xì)胞中NF-κBp65蛋白的表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.原位雜交結(jié)果:食管癌EC9706細(xì)胞中NF-κBp65mRNA活性高,不同濃度的PN(20-50μmol/L)作用EC9706細(xì)胞24h、48h和72h后NF-κBp65mRNA活性逐

11、漸降低,三個(gè)時(shí)間段內(nèi)不同濃度組間的比較及相同濃度不同時(shí)間段的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PN抑制EC9706細(xì)胞中NF-κBp65mRNA的活性具有時(shí)間和劑量依賴性；5-FU(25μg/mL)組EC9706細(xì)胞中NF-κBp65mRNA活性略有增強(qiáng)；聯(lián)合組NF-κBp65mRNA的活性明顯降低,與單一5-FU組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果:三個(gè)時(shí)間段不同濃度PN組、單一5-FU組

12、和聯(lián)合組與對(duì)照組比較,細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；相同濃度不同作用時(shí)間組的早期凋亡率和晚期調(diào)亡率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.小白菊內(nèi)酯可以抑制食管癌EC9706細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 2小白菊內(nèi)酯可以增加EC9706對(duì)化療藥5-FU的敏感性。
　　 3.小白菊內(nèi)酯抗腫瘤機(jī)制可能與抑