小白菊內(nèi)酯及順鉑對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖、凋亡影響的研究.pdf

1、研究背景:
　　 結(jié)腸癌是人體最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占胃腸道腫瘤的第2位。在歐美及中國(guó)都有很高的發(fā)病率，全球結(jié)腸癌每年新發(fā)病例超過(guò)100萬(wàn)例。中國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率由上世紀(jì)70年代初的12/10萬(wàn)增長(zhǎng)到目前的56/10萬(wàn)，升速約為每年4.2％，遠(yuǎn)超2％的國(guó)際水平。目前，針對(duì)該病的治療主要是采用手術(shù)、化療為主的多種治療手段結(jié)合的綜合治療。對(duì)早期結(jié)腸癌的治療效果相對(duì)較好，Ⅰ～Ⅱ期結(jié)腸癌患者5年生存率可以達(dá)到70～90％以上。但對(duì)于中晚期結(jié)

2、腸癌患者而言，效果并不理想。因腫瘤侵犯、多處轉(zhuǎn)移等原因?qū)е螺^多患者就診時(shí)即失去根治性手術(shù)治療的機(jī)會(huì)而僅能進(jìn)行姑息性手術(shù)、化療等姑息性治療。當(dāng)然，手術(shù)+化療為主的綜合治療仍是中晚期結(jié)腸癌患者較為合適的選擇。但因有較多結(jié)腸癌患者長(zhǎng)期化療后可能出現(xiàn)耐藥，對(duì)化療藥物敏感性較低而影響療效，甚至部分還可因出現(xiàn)較嚴(yán)重的化療副反應(yīng)而無(wú)法進(jìn)行化療，從而影響整體治療效果。我們知道，腫瘤耐藥機(jī)制復(fù)雜，一般由以下三方面原因?qū)е拢醇?xì)胞動(dòng)力學(xué)所致的耐藥、生化原因

3、所致的耐藥和藥理學(xué)原因所致的耐藥。臨床上如果兩藥能起協(xié)同作用，則可在不影響療效前提下減少相互藥物用量，進(jìn)而有可能減少各自的毒副作用，克服由活性代謝物的低生成或高失活所引起的耐藥。臨床上如何克服腫瘤耐藥、提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性、減少臨床化療藥物的用量，進(jìn)而減少化療相關(guān)副反應(yīng)，順利完成化療過(guò)程對(duì)提高治療效果具有重要的臨床意義。
　　 此前有研究表明，從菊科植物中提取的一種倍半萜內(nèi)酯化合物小白菊內(nèi)酯具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，在體外可

4、抑制多種腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)增殖，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，比如肝癌、膽管癌及多發(fā)性骨髓瘤等。另外，小白菊內(nèi)酯還可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性，如增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。但目前該藥對(duì)結(jié)腸癌的作用方面的研究較少，它對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖與凋亡有何影響？是否可與其它化療藥物起協(xié)同作用、減少化療藥物的用量、進(jìn)而在臨床上增強(qiáng)療效、減少化療毒副反應(yīng)？順鉑是在人體實(shí)體腫瘤治療中使用較為廣泛的抗腫瘤藥，結(jié)腸癌治療中亦有廣泛應(yīng)用，尤其在晚期結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移產(chǎn)生腹水的

5、治療中有較好效果。雖然順鉑抗癌譜廣、作用強(qiáng)，但因其毒性反應(yīng)大、易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致順鉑在臨床應(yīng)用上受到一定的限制。因此尋找能夠增敏順鉑的治療藥物，減輕順鉑的毒副反應(yīng)具有重要的臨床意義。本研究中以人的結(jié)腸癌細(xì)胞SW620作為研究對(duì)象，采用小白菊內(nèi)酯及順鉑作用于SW620后，觀(guān)察它們對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及增殖有何影響，二者聯(lián)用是否有協(xié)同、增效功能。這對(duì)臨床上能否提高結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，減少化療藥物的用量，進(jìn)而減少化療相關(guān)副反應(yīng)等具有一定

6、的指導(dǎo)作用。
　　 1目的:
　　 結(jié)腸癌細(xì)胞SW620經(jīng)過(guò)小白菊內(nèi)酯及順鉑作用后，通過(guò)MTS法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀(guān)察小白菊內(nèi)酯及順鉑對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620細(xì)胞增殖及凋亡方面的影響，了解小白菊內(nèi)酯與順鉑二者聯(lián)合使用是否可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)？是否可以增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性？同時(shí)通過(guò)熒光定量PCR和western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)，初步探討其可能的影響機(jī)制，為小白菊內(nèi)酯用于臨床治療結(jié)腸癌，特別是與化

7、療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療結(jié)腸癌提供理論依據(jù)。
　　 2方法:
　　 2.1實(shí)驗(yàn)分組
　　 按細(xì)胞培養(yǎng)后藥物處理情況，實(shí)驗(yàn)分組情況如下:
　　 A).MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分組為:
　　 溶劑對(duì)照組（DMSO組）
　　 小白菊內(nèi)酯(PTL)各濃度組(5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L)
　　 順鉑(DDP)各濃度組(2.5μmol/L、5μmol/L、7

8、.5μmol/L、10μmol/L)
　　 小白菊內(nèi)酯和順鉑聯(lián)合組(DDP5μmol/L+PTL10μmol/L、DDP5μmol/L+PTL20μmol/L、DDP10μmol/L+PTL10μmol/L、DDP10μmol/L+PTL20 mol/L)
　　 B).流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及PCR、Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)基因、蛋白實(shí)驗(yàn)分組均為:
　　 溶劑對(duì)照組（DMSO組）
　　

9、 小白菊內(nèi)酯組(10μmol/L)
　　 順鉑組(5μmol/L)
　　 小白菊內(nèi)酯+順鉑組（10μmol/L+5μmol/L）
　　 注:從A部分實(shí)驗(yàn)MTS檢測(cè)兩藥聯(lián)合各濃度組中選出抑制率最高的一組作為B部分實(shí)驗(yàn)各組用藥濃度的選擇依據(jù)。
　　 2.2實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理
　　 SW620細(xì)胞接種于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37℃5％CO2培

10、養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)胰酶消化傳代。各組細(xì)胞藥物處理如下:
　　 2.2.2 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖
　　 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SW620細(xì)胞消化后，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔細(xì)胞為1×104個(gè)，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行藥物處理。藥物作用時(shí)間是24 h、48 h、72 h。收集各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞(0h，24h，48h，72h)加入MTS，比例為1/10。即100ul培養(yǎng)液加入10ul

11、檢測(cè)液。孵育4小時(shí)后，酶標(biāo)儀讀板，MTS檢測(cè)讀取OD490數(shù)據(jù)。采用金正均法判定兩藥物是否具有協(xié)同作用。也稱(chēng)概率相加法，具體的公式:q=EAB/(EA+EB-EA×EB)，公式中EAB為聯(lián)合處理組的抑制率EA、EB分別為A藥和B藥單獨(dú)處理的抑制率，若q值在0.85～1.15間為兩藥合用單純相加，若q＞1.15為有協(xié)同作用，若q＜0.85表示兩藥合用有拮抗作用。
　　 2.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡
　　 將SW620

12、細(xì)胞接種于6孔板，藥物處理48 h后收樣進(jìn)行流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)。胰酶消化細(xì)胞后，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞，將細(xì)胞輕輕重懸于預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液中使得其密度大約為1×106細(xì)胞/ml。加入1.25μlAnnexin V-FITC。室溫(18-24℃)避光反應(yīng)15分鐘。室溫800r/min離心5分鐘，去除上清。將細(xì)胞用0.5 ml預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸。加入10μlPropidium Iodide。將樣本放置在冰上避光保存。用流式細(xì)胞儀檢

13、測(cè)分析。
　　 2.2.4熒光定量PCR檢測(cè)
　　 將SW620細(xì)胞接種于6孔板，處理24 h后收集細(xì)胞樣品，加入1ml Trizol溶液，吹打混勻，使細(xì)胞充分裂解，靜置5min;加入200μL氯仿，沉淀蛋白;離心去上清，加入等體積的異丙醇沉淀RNA，用75％乙醇洗滌兩次，加入15～60μL DEPC水溶解沉淀。取1μL RNA樣品50倍稀釋?zhuān)贐ioPhotometer plus艾本德核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定OD值，OD2

14、60/OD280的比值大于1.8，說(shuō)明制備的RNA較純，無(wú)蛋白質(zhì)污染。在RNase free的PCR管中進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄，得到的eDNA用于PCR實(shí)驗(yàn)。各因子檢測(cè)引物如表1所示。擴(kuò)增條件是:95℃預(yù)變性5 min，95℃15 sec，50℃15 sec，72℃32 sec，30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5 min。
　　 定量PCR檢測(cè)中所用到的引物:
　　 2.2.5 Western Blot檢測(cè)
　　 將SW62

15、0細(xì)胞接種于6孔板，處理48 h后收集細(xì)胞樣品，RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白總濃度，每孔上樣量為30μg，8～12的分離膠分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5的脫脂奶粉室溫封閉1h，PBS稀釋一抗(Bax,1∶500; Caspase-3,1∶1500; Caspase-9,1∶1000; RARP,1∶1000;Bcl-2，1∶1000)4℃孵育過(guò)夜，次日，TBST洗膜3次，每次5 min;合適二抗室溫孵育1h;

16、 TBST洗膜3次，每次5 min;于暗室中進(jìn)行曝光。
　　 3結(jié)果:
　　 3.1 MTS檢測(cè)結(jié)果:將小白菊內(nèi)酯和順鉑稀釋成不同的濃度梯度，分別處理SW620細(xì)胞并進(jìn)行MTS檢測(cè)，單因素方差分析的結(jié)果顯示各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，小白菊內(nèi)酯及順鉑均對(duì)SW620細(xì)胞的增殖有抑制作用。多重比較顯示各試驗(yàn)組均與溶劑對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同試驗(yàn)時(shí)間和不同試劑類(lèi)型均會(huì)影響SW620細(xì)胞的增殖抑制率，對(duì)于同一試劑，不同濃度對(duì)抑制率亦

17、有影響。對(duì)試劑類(lèi)型和試驗(yàn)時(shí)間進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示試驗(yàn)類(lèi)型三組間均有顯著差異，小白菊內(nèi)酯和順鉑(PTL+DDP)組對(duì)SW620細(xì)胞的增殖抑制率最高，其次是小白菊內(nèi)酯(PTL)組，順鉑(DDP)組最低。相同濃度下小白菊內(nèi)酯和順鉑對(duì)SW620細(xì)胞的增殖抑制率亦顯示小白菊內(nèi)酯組比順鉑組高，二者對(duì)SW620細(xì)胞的增殖抑制作用均表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。聯(lián)合作用時(shí)對(duì)SW620細(xì)胞的增殖抑制作用較單藥作用時(shí)增強(qiáng)。金正均法檢測(cè)顯示，小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合組各組

18、q值均介于0.85～1.15之間，說(shuō)明兩藥聯(lián)用時(shí)對(duì)SW620細(xì)胞的增殖的抑制作用可相加，亦無(wú)拮抗作用。但兩藥在抑制SW620細(xì)胞的增殖方面沒(méi)有協(xié)同效應(yīng)。
　　 3.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示小白菊內(nèi)酯和順鉑單用組的SW620細(xì)胞凋亡率顯著高于溶劑對(duì)照組，二者聯(lián)用組細(xì)胞凋亡率高于單藥組。溶劑對(duì)照組、小白菊內(nèi)酯組、順鉑組和小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)用組早期凋亡的比例分別為1.25％、5.69％、3.65和8.36％，晚期凋亡的比例卻變化不大，分別

19、為5.21％、6.58％、6.03％和7.86％。
　　 3.3熒光定量PCR檢測(cè)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因caspase3、caspase9、PARP、Bcl-2及Bax的mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果提示:小白菊內(nèi)酯和順鉑的單獨(dú)作用可以明顯下調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平，二者聯(lián)合作用時(shí)效果更明顯。順鉑處理SW620細(xì)胞后，caspase3、caspase9、Bax及PARP的mRNA水平的表達(dá)量出現(xiàn)了上調(diào);小白菊內(nèi)酯處理后，caspase3、ca

20、spase9、Bax及PARP的mRNA水平的表達(dá)量亦出現(xiàn)了上調(diào);聯(lián)合作用后，四個(gè)凋亡相關(guān)基因的mRNA水平的表達(dá)較單用組上調(diào)更明顯。
　　 3.4用western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示小白菊內(nèi)酯作用后SW620細(xì)胞中的Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯降低，而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)水平則明顯增高;小白菊內(nèi)酯處理后，SW620細(xì)胞中caspase3、caspase9及PARP的蛋白水平的表達(dá)量也出現(xiàn)了上調(diào)。使用順鉑處

21、理的細(xì)胞，檢測(cè)蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與小白菊內(nèi)酯相似。二者聯(lián)合時(shí)，上述變化更加明顯。
　　 4結(jié)論:
　　 4.1小白菊內(nèi)酯及順鉑對(duì)SW620細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并均表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。兩藥聯(lián)用時(shí)對(duì)SW620細(xì)胞的增殖的抑制作用可相加，無(wú)拮抗作用。但兩藥在抑制SW620細(xì)胞的增殖方面沒(méi)有協(xié)同效應(yīng)。
　　 4.2小白菊內(nèi)酯及順鉑均能促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡，二者聯(lián)用時(shí)效果更明顯。二者對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的影響可能是通過(guò)下調(diào)