脂肪因子chemerin與充血性心力衰竭的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分：脂肪因子chemerin與充血性心胃衰竭的相關(guān)性研究
　　目的:晚近發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子chemerin在胰島素抵抗和免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。充血性心力衰竭(CHF)與后兩者密切相關(guān)。由此本部分檢測CHF患者體循環(huán)中chemerin水平的變化，并探討其與心衰相關(guān)臨床生化指標(biāo)之間的關(guān)系。
　　方法:臨床入選52位充血性心力衰竭患者(CHF組)，52位心功能正常的心血管疾病患者(NHF組)，兩組平均年齡70.9±1.

2、6歲，男性比例73％和26例健康人群為正常對照組(NCD組)，平均年齡67.9±2.4歲，男性比例65%，使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測chemerin及TNF-α的外周血濃度，同時(shí)檢測相關(guān)的臨床生化指標(biāo)。統(tǒng)計(jì)chemerin與各生化指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果:①CHF組患者血漿chemerin水平(220.0±9.7ng/ml)較NHF組患者(165.6±8.0ng/ml，P<0.001)及正常對照組(147.2±11.

3、3ng/ml，P<0.001)明顯升高；②CHF組，心力衰竭嚴(yán)重程度按紐約心臟協(xié)會(huì)(NYHA)分級(jí)后分組，心功能 IV級(jí)患者的血漿chemerin水平(n=9，294.8±69.0ng/ml)較心功能III級(jí)(n=17，221.6±58.7ng/ml，P<0.01)和II級(jí)患者(n=26，193.0±63.0ng/ml，P<0.01)更高；③ Spearman相關(guān)分析顯示血漿chemerin水平與體質(zhì)指數(shù)(r=0.340，P=0.013

4、)、左室射血分?jǐn)?shù)(r=-0.337，P=0.014)、甘油三酯(r=0.279，P=0.046)、HOMA-IR(r=0.389，P=0.004)、TNF-α(r=0.379，P=0.006)、NT-proBNP(r=0.336，P=0.008)、同型半胱氨酸(r=0.285，P=0.041)相關(guān)；④多元逐步回歸分析顯示在CHF組和NHF組，血漿chemerin水平都與代表胰島素抵抗的指標(biāo)HOMA-IR(β=0.340，P=0.006)

5、和肥胖相關(guān)指標(biāo)體重指數(shù)BMI(β=0.323，P=0.008)顯著正相關(guān)；經(jīng)過年齡和性別校正后，TNF-α(β=0.376，P=0.002)僅在CHF組與血漿chemerin正相關(guān)。
　　第二部分：脂肪因子Chemerin在心室重構(gòu)心臟成纖維細(xì)胞增殖中作用的初步研究
　　目的:心臟成纖維細(xì)胞(CFb)作為CHF心室重構(gòu)中的主要參與者，其增殖是心室重構(gòu)心肌纖維化的重要原因。本部分在本課題臨床部分CHF患者血漿中chemerin

6、水平顯著升高結(jié)果基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建體外心肌纖維化模型，并檢測CFb增殖過程中chemerin表達(dá)變化，以及沉默chemerin基因表達(dá)后，對CFb增殖的影響，初步探討chemerin在心室重構(gòu)CFb增殖中的作用，明確chemerin在心力衰竭中的可能病理生理作用。
　　方法:1. Chemerin在心臟組織mRNA及蛋白水平表達(dá)的檢測:使用聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)檢測心臟組織及心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)情

7、況；免疫組織化學(xué)染色法檢測SD大鼠心臟組織chemerin蛋白的表達(dá)；并進(jìn)一步通過細(xì)胞免疫熒光法明確chemerin蛋白在心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞的表達(dá)定位；2.血管緊張素II(AngII)刺激CFb增殖過程中chemerin表達(dá)水平變化的檢測:采用原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)SD大鼠乳鼠的CFb，以AngⅡ1×10-7mol/L誘導(dǎo)CFb增殖建立心肌纖維化細(xì)胞模型，分4個(gè)時(shí)間梯度(0h、6h、12h、24h)進(jìn)行，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q

8、T-PCR)檢測CFb增殖過程中設(shè)置的時(shí)間點(diǎn)chemerin mRNA的表達(dá)情況；同時(shí)用AngⅡ受體AT1阻滯劑纈沙坦阻斷AngⅡ誘導(dǎo)的CFb增殖，采用QT-PCR檢測chemerin mRNA的表達(dá)水平。3. Chemerin在AngII刺激CFb增殖過程中作用的研究:設(shè)計(jì)及合成chemerin基因的小分子干擾RNA(siRNA)，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染到CFb內(nèi)沉默chemerin基因表達(dá)，通過CCK-

9、8實(shí)驗(yàn)觀察chemerin基因沉默對AngⅡ誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:1. chemerin在SD大鼠乳鼠的心臟組織RNA及蛋白水平有表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光顯示主要 chemerin主要存在于心臟成纖維細(xì)胞胞漿中，而新生鼠心肌細(xì)胞中表達(dá)量較低。2.AngII刺激CFb后6小時(shí)，chemerin表達(dá)量下降至最低，此后chemerin在12小時(shí)和24小時(shí)后表達(dá)量逐漸恢復(fù)；使用AT1受體阻滯劑纈沙坦可明顯抑制AngII刺激

10、導(dǎo)致chemerin表達(dá)下調(diào)的作用。3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA至CFb，QT-PCR及免疫印跡方法篩選出最有效的沉默片段，沉默效率達(dá)X%，使用此片段在CCK-8實(shí)驗(yàn)中沉默CFb中chemerin表達(dá)。
　　結(jié)論:脂肪因子chemerin主要在心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)，在AngⅡ刺激CFb增殖的心肌纖維化細(xì)胞模型中表達(dá)顯著下調(diào)，從而起到保護(hù)/損害心肌作用，提示chemerin可能通過內(nèi)分泌、自分泌及旁分泌方式在心力衰竭心室重構(gòu)過程中發(fā)揮重要