補腎活血法對人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞IL-1β-MAPK信號通路的影響.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是老年退行性關(guān)節(jié)疾病，其主要的病理改變是軟骨細胞的過度凋亡和細胞外基質(zhì)的降解。在骨關(guān)節(jié)炎病理改變這一過程中，細胞因子起到了關(guān)鍵作用，不僅可以促進軟骨細胞分泌降解酶，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的失衡，而且加速軟骨細胞的凋亡。其中，白介素-1在眾多細胞因子中是最重要的降解因子。白介素-1通過MAPKs信號通路及核因子-κB對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的異常調(diào)控是導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解的主要途徑。目前已經(jīng)證實在MA

2、PK家族中參與OA發(fā)病的有JNK、p38激酶及ERK，其中ERK1/2主要是促進增殖，調(diào)控細胞的終末分化，而JNK和p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是參與炎癥反應(yīng)調(diào)控的重要信號。核因子-κB結(jié)合多種基因啟動子或增強子上的特異位點，促使相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。其中最典型核因子-κB的是以p65和p50兩個亞基組成二聚體形式存在。在OA中MAPKs信號通路及核因子-κB介導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶是降解細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，可以降解幾乎所有的細胞外基質(zhì)，其中MMP-

3、1、MMP-3、MMP-13是加速OA發(fā)生發(fā)展的主要蛋白酶。因此，調(diào)節(jié)IL-1介導(dǎo)的MAPKs信號通路及核因子-κB的穩(wěn)定，下調(diào)MMPs的產(chǎn)生，延緩OA的病理變化，將為防治OA提供新靶點。
　　本課題在補腎活血法治療OA的學術(shù)思想指導(dǎo)下，以國家自然科學基金為依托，以體外培養(yǎng)的人OA軟骨細胞作為研究對象，采用牛膝健步顆粒含藥血清干預(yù)，借助CCK-8法、western blotting等技術(shù)，檢測IL-1β調(diào)節(jié)MAPKs信號通路及核因

4、子-κB相關(guān)因子ERK、P-38、JNK、P-65，下游MMP-3、-13蛋白的表達狀況，探索補腎活血法干預(yù)OA的病理機制，為藥物治療OA的研究提供一種新思路。
　　實驗一:人OA軟骨細胞MAPKs/核因子-κ B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的的表達狀況
　　目的:以正常軟骨細胞為對照，觀察人OA軟骨細胞中MAPKs及核因子-κB信號表達狀況。
　　方法:采用Western blot技術(shù)比較正常軟骨細胞與OA軟骨細胞MAPKs亞家族E

5、RK，P38，JNK及核因子-κB p65轉(zhuǎn)導(dǎo)因子表達情況。
　　結(jié)果:OA軟骨細胞MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子ERK、P38、JNK、P65蛋白表達較正常軟骨細胞明顯增強，有顯著性意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:MAPKs信號通路及核因子-κB轉(zhuǎn)導(dǎo)因子在OA軟骨細胞中的顯著表達，與OA發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　實驗二:牛膝健步顆粒對人OA軟骨細胞MAPKs及核因子-κB的影響
　　目的:觀察牛膝健步顆粒是否對OA軟骨細

6、胞MAPKs及核因子-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子具有調(diào)節(jié)作用。
　　方法:將OA軟骨細胞分成5組，分別為OA軟骨細胞組、OA軟骨細胞組+對照血清組、OA軟骨細胞組+含藥血清小劑量組、OA軟骨細胞組+含藥血清中劑量組、OA軟骨細胞組+含藥血清大劑量組，培養(yǎng)48h后，采用Western blot技術(shù)檢測各組細胞ERK、P38、JNK、P65蛋白表達情況。
　　結(jié)果:牛膝健步顆粒能夠抑制ERK、P38、P65轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，且抑制P38轉(zhuǎn)導(dǎo)因子呈

7、現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系(P＜0.05);牛膝健步顆粒對JNK信號表達具有促進作用，明顯高于OA組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:牛膝健步顆粒能夠干預(yù)MAPK信號通路及核因子-κB的轉(zhuǎn)導(dǎo)，對軟骨具有保護作用。
　　實驗三:IL-1β對人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞MAPK及核因子-κB信號的影響
　　目的:觀察IL-1β誘導(dǎo)OA軟骨細胞MAPK和核因子-κB信號表達的情況。
　　方法:采用CCK-8法測定不同濃度IL-1β(0ng/m

8、l、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)抑制OA軟骨細胞增殖情況。采用Western blot技術(shù)檢測OA軟骨細胞組和IL-1β組P38、JNK、P65、MMP-3、MMP-13蛋白表達情況。
　　結(jié)果:1ng/ml～100ng/ml IL-1β呈時效-量效關(guān)系抑制OA軟骨細胞增殖;且10ng/ml IL-1β作用48h對OA軟骨細胞生長抑制作用較平穩(wěn)，為最佳濃度;10ng/ml IL-1β誘導(dǎo)OA軟骨細胞JNK、P3

9、8及P65、MMP-3、MMP-13蛋白表達明顯增強，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:在10ng/ml濃度下，IL-1β可以抑制OA軟骨細胞的增殖，顯著誘導(dǎo)MAPKs和核因子-κB信號通路表達，很好的模擬了OA病理環(huán)境，為最佳效應(yīng)濃度。
　　實驗四:牛膝健步顆粒對IL-1β體外誘導(dǎo)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖的影響
　　目的:觀察牛膝健步顆粒對IL-1β誘導(dǎo)OA軟骨細胞增殖的影響。
　　方法:將OA軟骨細胞

10、隨機分為6組，分別為OA軟骨細胞組+胎牛血清;OA軟骨細胞組+對照血清+10ng/mlIL-1β; OA軟骨細胞組+含藥血清小劑量+10ng/mlIL-1β; OA軟骨細胞組+含藥血清中劑量+10ng/mlIL-1β; OA軟骨細胞組+含藥血清大劑量+10ng/mlIL-1β;10ng/mlIL-1β模型組+胎牛血清，根據(jù)分組情況培養(yǎng)細胞24h、48h、72h后，應(yīng)用CCK-8法比較各組細胞增殖情況。
　　結(jié)果:牛膝健步顆粒大、中

11、、小組含藥血清組對IL-1β誘導(dǎo)OA軟骨細胞增殖作用與OA組相比在48h后沒有明顯的差異，較24h時10ng/mlIL-1β模型組顯著升高。
　　結(jié)論:牛膝健步顆?？梢源龠MOA軟骨細胞增殖，這可能是保護軟骨細胞的機制之一。
　　實驗五:牛膝健步顆粒對人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞IL-1β/MAPKs及核因子-κB/MMPs信號通路的影響
　　目的:觀察牛膝健步顆粒是否對OA軟骨細胞IL-1β/MAPKs及核因子-κB/MMPs信

12、號通路具有調(diào)節(jié)作用。
　　方法:將軟骨細胞分成OA軟骨細胞組、OA軟骨細胞組+對照血清組+10ng/mlIL-1β、OA軟骨細胞組+含藥血清小劑量組+10ng/mlIL-1β、OA軟骨細胞組+含藥血清中劑量組+10ng/mlIL-1β、OA軟骨細胞組+含藥血清大劑量組+10ng/mlIL-1β，根據(jù)分組情況培養(yǎng)細胞48h后，采用Western blot技術(shù)檢測各組蛋白表達情況。
　　結(jié)果:牛膝健步顆?？梢悦黠@抑制IL-1誘導(dǎo)