人FLT3配體胞外段基因克隆及其在CHO細胞中的表達.pdf

1、【研究背景及意義】 Flt3配體(Flt3 Ligand，F(xiàn)L)是一種能夠調(diào)節(jié)早期造血的關(guān)鍵性細胞因子，與Ⅲ型酪氨酸激酶受體Flt3 (FMS-like tyrosinekinase 3) 結(jié)合，在多種疾病的病理生理過程中起重要作用。人的 FL 基因位于染色體 19q13.3-13.4，約為5.9kb，其cDNA由8個外顯子構(gòu)成。突變研究證明外顯子1～5(胞外區(qū)的大部分)編碼了具備生物學功能所需的足夠信息。人FL蛋白屬于Ⅰ型跨膜

2、蛋白，包括兩個N-末端糖基化區(qū)域，由235個氨基酸組成。開始的26個氨基酸組成信號肽，成熟蛋白質(zhì)不含此序列。以下順序為細胞外區(qū)(156個氨基酸)，跨膜區(qū)(23個氨基酸)以及胞漿區(qū)(30個氨基酸)。FL通過差異剪接形成跨膜型和可溶型兩種主要形式，兩種均有生物學活性，人FL的主要剪接體是跨膜型蛋白，在細胞表面發(fā)揮生物學作用，它也可以被蛋白酶裂解成可溶性FL。 目前研究發(fā)現(xiàn)FL單獨作用對刺激造血的效果并不明顯，但它與IL-3、IL-6

3、、G-CSF、GM-CSF 和 SCF等細胞因子聯(lián)用，對原始造血干/祖細胞能產(chǎn)生強烈的增殖效應，其機制為FL與FLT3受體結(jié)合后，后者發(fā)生二聚體化，使得激酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生改變，酪氨酸殘基磷酸化，RAS-GAP、PLC-7、PI3-激酶、STAT5和EI1/2 等底物蛋白被激活，通過一系列細胞內(nèi)信號傳遞，細胞增殖信號轉(zhuǎn)導入細胞核，從而使造血干細胞發(fā)生增殖和活化。此外，F(xiàn)L還可促進前B淋巴細胞和T淋巴細胞的生長、分化，對DC細胞和NK細胞

4、具有促進分化、使其功能成熟等作用。 由于FL不僅能刺激造血，還能提高機體的免疫功能，因此在干細胞體外擴增移植、外周血干細胞動員、腫瘤免疫治療和防治輻射所致骨髓抑制等方面具有誘人的應用前景。 目前國內(nèi)外研究主要用酵母或大腸桿菌來表達FL蛋白。本課題從人外周血單個核細胞分離出 FL cDNA，將其與真核表達載體 pcDNA3.0連接，并在真核哺乳類CHO細胞中獲得FL的較高表達，以便使FL更好地應用于臨床。 【方法】

5、 從新鮮的健康人外周血單個核細胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)Genebank中FL序列(登記號NM001459)的FL胞外段基因序列設(shè)計內(nèi)、外側(cè)引物各一對，內(nèi)側(cè)引物含BamH I和EcoR V酶切位點，PCR擴增cDNA。PCR產(chǎn)物和真核表達載體pcDNA3.0分別經(jīng)雙酶切后凝膠回收純化，用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化用氯化鈣法制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5α。從氨芐青霉素陽性的LB轉(zhuǎn)化平板上隨機挑取單菌落，增菌并提取質(zhì)粒，進行P

6、CR鑒定和酶切鑒定，含有目的片斷的為陽性重組子，對FL-pcDNA3.0插入片段進行序列測定。 采用無菌操作提取并純化FL-pcDNA3.0質(zhì)粒，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞CHO，轉(zhuǎn)染后24小時用G418 400μg/ml選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)陽性克隆，獲得穩(wěn)定生長并表達FL目的蛋白的陽性克隆細胞株。提取細胞總蛋白，用Western Blotting法鑒定轉(zhuǎn)染細胞表達FL蛋白的分子量。 【結(jié)果】 人外周

7、血單個核細胞分離出中提取的總RNA經(jīng)RT-PCR擴增，1.5％瓊脂糖凝膠電泳可見一條特異性條帶，位置接近500bp，其大小與預計片段大小基本一致，而陰性對照未見任何條帶。陽性重組子經(jīng)PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳可見目的條帶，經(jīng)雙酶切后顯示目的條帶和5.4kh的pcDNA3.0條帶。序列測定結(jié)果與Genebank中FL序列(登記號NM001459)同源性為99.8％。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞CHO，經(jīng)篩選和鑒定得到穩(wěn)定表