人FLT3配體胞外段基因克隆及其在CHO細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、【研究背景及意義】 Flt3配體(Flt3 Ligand，F(xiàn)L)是一種能夠調(diào)節(jié)早期造血的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，與Ⅲ型酪氨酸激酶受體Flt3 (FMS-like tyrosinekinase 3) 結(jié)合，在多種疾病的病理生理過(guò)程中起重要作用。人的 FL 基因位于染色體 19q13.3-13.4，約為5.9kb，其cDNA由8個(gè)外顯子構(gòu)成。突變研究證明外顯子1～5(胞外區(qū)的大部分)編碼了具備生物學(xué)功能所需的足夠信息。人FL蛋白屬于Ⅰ型跨膜

2、蛋白，包括兩個(gè)N-末端糖基化區(qū)域，由235個(gè)氨基酸組成。開(kāi)始的26個(gè)氨基酸組成信號(hào)肽，成熟蛋白質(zhì)不含此序列。以下順序?yàn)榧?xì)胞外區(qū)(156個(gè)氨基酸)，跨膜區(qū)(23個(gè)氨基酸)以及胞漿區(qū)(30個(gè)氨基酸)。FL通過(guò)差異剪接形成跨膜型和可溶型兩種主要形式，兩種均有生物學(xué)活性，人FL的主要剪接體是跨膜型蛋白，在細(xì)胞表面發(fā)揮生物學(xué)作用，它也可以被蛋白酶裂解成可溶性FL。 目前研究發(fā)現(xiàn)FL單獨(dú)作用對(duì)刺激造血的效果并不明顯，但它與IL-3、IL-6

3、、G-CSF、GM-CSF 和 SCF等細(xì)胞因子聯(lián)用，對(duì)原始造血干/祖細(xì)胞能產(chǎn)生強(qiáng)烈的增殖效應(yīng)，其機(jī)制為FL與FLT3受體結(jié)合后，后者發(fā)生二聚體化，使得激酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生改變，酪氨酸殘基磷酸化，RAS-GAP、PLC-7、PI3-激酶、STAT5和EI1/2 等底物蛋白被激活，通過(guò)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核，從而使造血干細(xì)胞發(fā)生增殖和活化。此外，F(xiàn)L還可促進(jìn)前B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化，對(duì)DC細(xì)胞和NK細(xì)胞

4、具有促進(jìn)分化、使其功能成熟等作用。 由于FL不僅能刺激造血，還能提高機(jī)體的免疫功能，因此在干細(xì)胞體外擴(kuò)增移植、外周血干細(xì)胞動(dòng)員、腫瘤免疫治療和防治輻射所致骨髓抑制等方面具有誘人的應(yīng)用前景。 目前國(guó)內(nèi)外研究主要用酵母或大腸桿菌來(lái)表達(dá)FL蛋白。本課題從人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離出 FL cDNA，將其與真核表達(dá)載體 pcDNA3.0連接，并在真核哺乳類CHO細(xì)胞中獲得FL的較高表達(dá)，以便使FL更好地應(yīng)用于臨床。 【方法】

5、 從新鮮的健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)Genebank中FL序列(登記號(hào)NM001459)的FL胞外段基因序列設(shè)計(jì)內(nèi)、外側(cè)引物各一對(duì)，內(nèi)側(cè)引物含BamH I和EcoR V酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增cDNA。PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pcDNA3.0分別經(jīng)雙酶切后凝膠回收純化，用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化用氯化鈣法制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5α。從氨芐青霉素陽(yáng)性的LB轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取單菌落，增菌并提取質(zhì)粒，進(jìn)行P

6、CR鑒定和酶切鑒定，含有目的片斷的為陽(yáng)性重組子，對(duì)FL-pcDNA3.0插入片段進(jìn)行序列測(cè)定。 采用無(wú)菌操作提取并純化FL-pcDNA3.0質(zhì)粒，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用G418 400μg/ml選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)并表達(dá)FL目的蛋白的陽(yáng)性克隆細(xì)胞株。提取細(xì)胞總蛋白，用Western Blotting法鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)FL蛋白的分子量。 【結(jié)果】 人外周

7、血單個(gè)核細(xì)胞分離出中提取的總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，1.5％瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)一條特異性條帶，位置接近500bp，其大小與預(yù)計(jì)片段大小基本一致，而陰性對(duì)照未見(jiàn)任何條帶。陽(yáng)性重組子經(jīng)PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)目的條帶，經(jīng)雙酶切后顯示目的條帶和5.4kh的pcDNA3.0條帶。序列測(cè)定結(jié)果與Genebank中FL序列(登記號(hào)NM001459)同源性為99.8％。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO，經(jīng)篩選和鑒定得到穩(wěn)定表