人巨細(xì)胞病毒對(duì)臍血紅系祖細(xì)胞HOXB6基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(fluorogenicquantitivereversetranscriptionpolymerizechainreaction,FQ-RT-PCR)方法，檢測(cè)經(jīng)人巨細(xì)胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)感染和/或全反式維甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)和/或三氧化二砷(arsenictrioxide，ATO，AS2O3)處理的人臍血造血紅系祖

2、細(xì)胞(ColonyFormingUnit-Erythroid，CFU-E；BrustFormingUnit-Erythroid，BFU-E)的HOXB6(homeoboxB6gene)基因的mRNA定量表達(dá)情況，在基因水平探討HCMV感染導(dǎo)致造血紅系祖細(xì)胞損害的機(jī)制。 方法：1.3例臍血標(biāo)本由本院產(chǎn)房提供，取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤段臍血。采用造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，以HCMV持續(xù)感染和/或ATRA和/或AS2O3處理人

3、臍血紅系祖細(xì)胞，觀察HCMV感染后和/或ATRA和/或AS2O3處理后的CFU-E，BFU-E集落形態(tài)及峰期。2.實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分成6組①空白對(duì)照組：在正常培養(yǎng)體系中，不加任何的處理因素。②HCMV組：按100TCID50HCMV-AD169病毒液0.1ml感染正常的培養(yǎng)體系。③ATRA組：在正常培養(yǎng)體系中加入維甲酸，終濃度為10-6mol/l。④HCMV+ATRA組：在上述同樣的人巨細(xì)胞病毒組中加入維甲酸，終濃度同上。⑤AS2O3組：

4、在正常培養(yǎng)體系中加入三氧化二砷，終濃度為10-6mol/l。⑥HCMV+AS2O3組：在上述同樣的人巨細(xì)胞病毒組中加入三氧化二砷，終濃度同上。3.采用原位聯(lián)苯胺染色法鑒定紅系祖細(xì)胞。4.不同時(shí)間點(diǎn)即第3天，第7天，第10天分別提取各組細(xì)胞RNA，用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA分子的完整性。5.利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)和隨機(jī)引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)基因特異引物在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行體外擴(kuò)增。將H

5、OXB6基因cDNA和人磷酸甘油醛脫氫酶(gluceraldehydephosphatedehydrogenase,GAPDH)基因陽(yáng)性產(chǎn)物cDNA梯度稀釋制作各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各個(gè)樣本循環(huán)指數(shù)增長(zhǎng)期的起始點(diǎn)即循環(huán)域值(cyclethreshold,Ct)和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率值計(jì)算各樣本起始cDNA模板量倍數(shù)值，以GAPDH基因作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化，統(tǒng)計(jì)并分析各組樣本的HOXB6基因表達(dá)的mRNA是否存在差異。統(tǒng)計(jì)方法：結(jié)果用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(

6、-x±S)，進(jìn)行單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后組間均數(shù)用兩兩比較方法，由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5完成。 結(jié)果：1.集落細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定，原位聯(lián)苯胺染色法證明所培養(yǎng)的是造血紅系祖細(xì)胞。2.1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5s,18s,28s三條帶型整齊，無(wú)明顯拖尾及彌散，說(shuō)明RNA結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯降解。3.逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增三組均有目的基因HOXB6和內(nèi)參照GAPDH基因的cDNA的產(chǎn)生，與DNA分子Marker相比示擴(kuò)

7、增產(chǎn)物大小分別為119bp和141bp。4.HOXB6基因mRNA在6個(gè)組即正常的紅系祖細(xì)胞，HCMV感染后的紅系祖細(xì)胞，以及ATRA和AS2O3處理過(guò)的紅系祖細(xì)胞和先感染HCMV后用ATRA/AS2O3處理的紅系祖細(xì)胞中定量表達(dá)情況，經(jīng)過(guò)單因素方差分析和SPSS11.5forwindows統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)體系中紅系祖細(xì)胞隨第3天，第7天，第10天時(shí)間推移持續(xù)表達(dá)HOXB6基因，且表達(dá)持續(xù)上調(diào)；在HCMV感染后，紅系祖細(xì)胞H

8、OXB6基因的表達(dá)隨著第3天，7天，10天時(shí)間的推移與空白對(duì)照組比較，明顯持續(xù)下調(diào)，即表達(dá)被抑制；ATRA組與空白對(duì)照組比較，能持續(xù)顯著上調(diào)紅系祖細(xì)胞的HOXB6基因的表達(dá)，且隨著第3天，第7天，第10天時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸升高；ATRA也能上調(diào)對(duì)HCMV感染后的第3天和第7天紅系祖細(xì)胞的HOXB6基因的表達(dá)，但是ATRA對(duì)HCMV感染后的第10天紅系祖細(xì)胞HOXB6基因的表達(dá)與空白對(duì)照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異；AS2O3與空白對(duì)照組比

9、較，能隨著時(shí)間推移逐漸下調(diào)紅系祖細(xì)胞和HCMV感染后的紅系祖細(xì)胞的HOXB6基因的表達(dá)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與HCMV組比較，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：1.HOXB6基因在臍血紅系造血祖細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，且與紅系造血有密切的相關(guān)性。2.HCMV感染能誘導(dǎo)臍血紅系造血祖細(xì)胞HOXB6基因表達(dá)下調(diào)，HCMV有可能通過(guò)調(diào)控HOXB6基因表達(dá)異常而引起造血系統(tǒng)損害。3.ATRA和AS2O3可以調(diào)控HOXB6基因的表達(dá)。4.本實(shí)驗(yàn)采用T