人巨細胞病毒感染ECV304細胞的病變效應及基因組表達譜研究.pdf

1、人巨細胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)是人類最常見的先天性感染病毒，HCMV的人群感染率高達80％以上，是目前引起孕婦活動性感染及胎兒宮內感染最常見的病因之一，造成出生缺陷，與弓形蟲(Toxoplasmosis)、風疹病毒(Rubellavirus)、單純瘡疹病毒(Herpessimplexvirus)、梅毒螺旋體(Syphilis)一起，并稱為人類五大生物致畸因子。同時，HCMV也是機體免疫功能低下的人群，

2、如艾滋病患者、放射損傷個體、器官移植和惡性腫瘤等病人并發(fā)感染死亡的常見原因之一。腎、肝、心臟、肺等器官移植后HCMV感染率分別達8％、29％、25％及39％。此外，HCMV還與心血管疾病、腫瘤的發(fā)生密切相關。因而，開展HCMV感染的病變特征與分子致病機制的研究，對于HCMV感染的防治和人口素質的提高都具有重要的意義。 HCMV即人類皰疹病毒5型(humanherpesvirus5，HHV-5)，屬于皰疹病毒β亞科。病毒顆粒為正二

3、十面體，核酸外殼由一個蛋白質包膜及脂質雙分子層組成，中間為病毒基質，成熟的病毒顆粒大小約200nm，其核衣殼直徑大小約為100nm。內部核酸為線性雙鏈DNA分子。HCMV基因組DNA大小為230kb，是動物DNA病毒基因組最大的一類，編碼了200多種不同的病毒蛋白，由長獨特序列(UniqueLong，UL)和短獨特序列(UniqueShort，US)及兩端的反向重復序列TRL、IRL、IRS及TRS組成，通過UL和US連接部位重復序列的

4、倒置，可形成四種同分異構體。 表達譜芯片能同時檢測成千個基因的表達，對來源于不同的個體、組織、發(fā)育階段、分化階段、病變及刺激下的細胞內mRNA總體表達水平進行檢測，從而對這些基因表達的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進行綜合的分析和判斷，可進一步研究基因與基因間相互作用的關系，提供細胞的表達調控信息。 表達譜芯片在研究包括病毒在內的病原與宿主細胞相互作用方面應用十分廣泛。宿主

5、細胞病原感染表達譜變化特征反應了病毒感染的結果，約有30種病毒和26種細菌感染25種不同類型的宿主細胞表達譜已被分析研究。以參與刺激的病原及宿主細胞的類型及作用方式歸納為8種模式：1.用野生型的病原體外直接感染宿主細胞，在多個感染階段監(jiān)測表達；2.多種病原體感染同一種宿主細胞，以尋找共同參與宿主細胞防御的基因；3.用突變株或滅活病原刺激宿主細胞；4.研究病原體的特殊蛋白成分致病性；5.同種病原感染正常及突變細胞系的對比研究；6.小分子物

6、質參與病原-宿主反應通路作用的研究；7.細胞體外感染病原后轉入體內后基因的差異表達研究；8.臨床樣本與動物模型差異表達的研究。 已有研究將DNA表達譜芯片應用于HCMV的相關研究，包括HCMV和宿主細胞的兩方面的感染表達譜研究。由于所基于的技術平臺不同，在芯片的類型，芯片的密度，探針的性質，樣本的標記方法等方面都有所不同，在結果上有所差異。這些研究采用自制的或傳統(tǒng)的DNA表達譜芯片，研究僅局限于HCMV基因組表達譜或宿主細胞表達

7、譜的某些方面。研究的細胞主要為人成纖維母細胞(HFF)。ECV304細胞是1990年首次報道，由一日本人的臍靜脈內皮細胞自發(fā)轉化為的一株永生化細胞株，曾作為血管內皮的模型在生物學及醫(yī)學研究中廣泛應用。本研究報道了血管內皮樣ECV304細胞體外感染HCMV的病變效應，并利用寡核苷酸表達譜芯片分析感染引起的宿主細胞基因組表達譜變化及其意義，旨在探索HCMV的致病相關分子機制。 本研究包括以下三個部分： 一、HCMV感染ECV

8、304血管內皮樣細胞的病變效應研究 用HCMVAD169感染ECV304血管內皮樣細胞，觀察病毒的感染對細胞生物性狀的影響。以常規(guī)方法傳代培養(yǎng)細胞和接種病毒，用PCR法和間接免疫熒光法分別檢測病毒即刻早期基因(IEgene)及HCMV特異的基質蛋白(pp65)，相差顯微鏡及電子顯微鏡觀察病毒感染后細胞形態(tài)及細胞內部變化，DNAladder法、TUNEL檢測細胞凋亡，流式細胞儀分析細胞周期及凋亡峰。 結果發(fā)現(xiàn)，ECV304

9、細胞病毒感染后2d開始出現(xiàn)變化，到感染4d變化明顯，出現(xiàn)感染細胞的胞體變圓、縮小、脫壁，胞漿內顆粒增多，細胞邊緣模糊的特征，通過對病毒特異IEgenePCR擴增及HCMV的基質蛋白(pp65)表達的檢測，明確了HCMV對ECV304血管內皮樣細胞的感染；電鏡觀察結果表明，病毒感染4d后，胞漿內明顯空泡化，細胞膜微絨毛減少，核染色質的濃集、邊緣化，線粒體出現(xiàn)溶酶體化、空泡化和自噬現(xiàn)象，形態(tài)學呈早期凋亡特征；DNALadder電泳結果顯示感

10、染細胞DNA片段化的特征條帶；流式細胞儀檢測感染4d和6d細胞凋亡率分別為4.1％和45.7％。細胞周期分析表明，到感染4d時S期細胞的增加，感染第6d，可見S期細胞明顯減少。結果提示，HCMV感染影響并調控了細胞內DNA合成，表現(xiàn)為細胞周期變化。本研究表明，巨細胞病毒在體外細胞培養(yǎng)中可誘導ECV304血管內皮樣細胞的凋亡。 二、基因組表達譜芯片篩選HCMV感染ECV304血管內皮樣細胞的差異表達基因 本部分研究中，用包

11、含18716個基因60mer寡核苷酸探針的表達譜芯片篩選HCMV感染ECV304血管內皮樣細胞的差異表達基因，旨在分子水平上探討HCMV的致病機制。收集HCMV感染4d的ECV304及對照細胞，用Trizol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測RNA樣本濃度和純度，并用cRNA線性擴增標記試劑盒進行雙色熒光標記，標記樣本與Agilent公司G4110BHuman1A(V2)Oligo芯片雜交，利用Agilent2565BA

12、基因芯片掃描儀進行圖像掃描，以AgilentG2567AAFeatureExtraction軟件篩選差異表達基因。芯片雜交結果表明，背景均一，信號點與背景熒光信號對比顯著，芯片雜交效果好。篩選得到的差異表達基因559個，471個基因表達上調，已明確功能的334個，有88個基因表達下調，已明確功能的有69個，這些差異表達基因功能可能涉及了HCMV感染調控的生物過程及致病機制。 三、表達譜芯片結果的驗證與生物信息學分析 對基

13、因表達譜芯片結果進行熒光定量PCR法驗證，以明確芯片實驗的準確可靠性，也是進一步數據挖掘和分析的前提。DNA表達譜芯片數據的生物信息學分析有助于更完整地了解基因的功能、調控和相互作用。選取RPS24、MGC8721、SLC27A3、MST4、TRAF25個上調基因和LRRC281個下調基因，采用SYBRGreenⅠ嵌合熒光法熒光定量PCR分析，對基因芯片表達譜結果進行驗證。用Onto-Express(OE)進行GeneOntology(

14、GO)定義的細胞分子生物過程分析，AnnotationDatabase軟件對病毒感染的生物過程涉及基因進行功能注解與分析。實驗結果顯示，芯片的結果與熒光定量的測定結果的結論一致。分析結果表明，HCMV感染ECV304細胞涉及273個生物過程，其中39個生物過程具有顯著性意義，包括：細胞信號轉導、依賴DNA的轉錄調節(jié)、血管形成、血管內皮生長因子調節(jié)、生殖發(fā)育、雌激素代謝、DNA復制依賴的核糖體裝配、衰老、上皮細胞分化、物質代謝、細胞周期調

15、節(jié)等生物過程。這些生物過程都是涉及了細胞內重要的生命活動，其中細胞信號轉導過程的統(tǒng)計學意義最為顯著(p=0.005)，表明HCMV對宿主細胞具有較強的轉錄調控能力，導致了細胞內的信號轉導的明顯變化。生物信息學的分析結果提示，許多顯著性分子生物過程及其組成基因可能與HCMV感染ECV304細胞的分子機制有關。HCMV感染引起的差異表達基因還涉及多個與HCMV感染及致病機制相關的生物學過程，這些生物過程及基因包括：細胞凋亡相關基因：Gran

16、zymeB、DAPK2、TARF2、TNFSF9、TNFSF10、Bcl-2L10、TGFBRAP1；G蛋白偶聯(lián)受體信號傳導通路基因：RGS6、RGS2、GIT1；c-Jun氨基末端激酶及MAPK通路組成基因：CRKL、SH2D3A.、MAP2K2；細胞周期相關基因：cyclinE、E2F；腫瘤相關基因：MYCL-2。 本研究主要結論如下：HCMVAD169可致ECV304血管內皮樣細胞病變，細胞周期發(fā)生變化，表現(xiàn)明顯凋亡特征。