ICAM-1在放射性肺損傷中的作用研究.pdf

1、放射性肺損傷（Radiation Pulmonary leision，RPL）是胸部腫瘤放射治療和骨髓移植全身照射預(yù)處理的常見嚴重并發(fā)癥和劑量限制因素，RPL屬于非感染性炎癥，一旦發(fā)生往往不可逆轉(zhuǎn)[1]，其發(fā)病機制至今尚不清楚，缺乏有效的預(yù)測指標和治療手段，成為胸部腫瘤得到有效治療的難題。細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是一重要的細胞間粘附分子和炎癥介質(zhì)，國際編號CD

2、54，它參與細胞的信號傳導(dǎo)與活化，細胞的伸展、移動、生長、分化，炎癥、血栓的形成，腫瘤轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷愈合等一系列重要的生理和病理過程[2]。ICAM-1在RPL中通過介導(dǎo)多形核嗜中性粒細胞(polymorphonuclear, PMN)等白細胞粘附、聚集于肺泡區(qū)域，是導(dǎo)致肺實質(zhì)細胞損傷及持續(xù)細胞因子釋放的關(guān)鍵因素，有報道表明抗ICAM-1抗體可以降低肺損傷的程度[3-4]，但目前關(guān)于ICAM-1在RPL中的具體作用機制及是否可以作為減輕放

3、射性肺損傷的新靶點尚待進一步研究。本文利用RNA干擾技術(shù)建立ICAM-1基因沉默細胞株以及應(yīng)用基因芯片技術(shù)具體從細胞與基因水平上分析其在RPL中的作用途徑及方式，為尋找防治RPL的有效措施提供理論依據(jù)和新思路。
　　 [目的]
　　 1.采用60Coγ射線照射建立小鼠放射性肺損傷模型，探討ICAM-1及相關(guān)因子在RPL中的表達變化。
　　 2.構(gòu)建ICAM-1基因沉默的小鼠肺腺癌細胞株(Lewis lung ce

4、ll，LLC)，探討ICAM-1基因沉默前后LLC細胞的生物學(xué)特性及基因表達譜的變化。
　　 3.探討ICAM-1基因沉默對LLC細胞輻射敏感性的影響。
　　 [方法]
　　 1.采用照射劑量為16Gy的60Coγ射線全肺單次照射建立小鼠放射性肺損傷模型，HE染色法觀察小鼠肺組織損傷，免疫組化及Elisa法測定小鼠肺ICAM-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGFβ1)及腫瘤壞死因子-α（TNF-α)的表達變化。

5、　　 2.①針對ICAM-1mRNA序列，篩選、設(shè)計并合成shRNA相關(guān)基因片段，構(gòu)建3條高特異性的 shRNA表達載體pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA，采用酶切及DNA測序法驗證插入序列的正確性。
　　 ②脂質(zhì)體法質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LLC細胞，遺傳霉素G418抗性篩選獲得陽性克隆。RT-PCR和Western blot法檢測shRNA對ICAM-1基因的沉默效率。
　　 ③應(yīng)用倒置顯微鏡觀察ICAM-1基因

6、沉默前后細胞形態(tài)變化，繪制生長曲線分析細胞生長分裂差異，采用MTT比色分析法測定其增殖活性，基因芯片技術(shù)分析LLC細胞中ICAM-1基因下調(diào)后全基因組表達譜的變化，篩選可能與ICAM-1信號通路有關(guān)的差異基因，尋找ICAM-1信號通路的傳導(dǎo)過程以及其在肺癌細胞增殖、遷移調(diào)控中的可能分子機制。
　　 3.采用照射劑量為4Gy的60Coγ射線照射ICAM-1基因沉默LLC細胞株，MTT法檢測輻照對其增殖活力的影響，集落形成率試驗檢測

7、其對輻照敏感性的變化，流式細胞儀檢測輻照對其細胞凋亡與周期的影響，探討ICAM-1在輻照后的小鼠肺腺癌LLC細胞株中的作用機制。
　　 [結(jié)果]
　　 1.與對照組比較，照射組的小鼠至照射后隨時間延長出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)有明顯脫落現(xiàn)象，肺呈充血水腫、不均質(zhì);肺泡壁增厚，炎性細胞浸潤明顯;肺組織中ICAM-1及其相關(guān)蛋白TGF-β1表達量明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)，TNF-α表達量有所增加，但與對照組比

8、較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2.①經(jīng)酶切和DNA測序鑒定，成功構(gòu)建了3條靶向抑制小鼠ICAM-1基因及一條陰性對照的 shRNA真核表達載體pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA。
　　 ②成功篩選穩(wěn)定抑制ICAM-1表達的永久性細胞克隆，RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測靶細胞在mRNA水平和蛋白水平上ICAM-1的抑制率分別為76.79％和79.01％(P＜0.01)。
　

9、　 ③與對照組比較，ICAM-1基因沉默組細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞生長分裂周期延長;MTT結(jié)果顯示沉默組細胞增殖活性降低;基因芯片結(jié)果提示在沉默組LLC-ICAM1細胞與對照組LLC-NC細胞間共有290個存在明顯差異表達的基因，其中表達上調(diào)的基因有238個，下調(diào)的基因有52個。
　　 3.MTT及集落形成率試驗結(jié)果表明ICAM-1基因沉默組對輻照的敏感度下降，在同等劑量的輻照條件下ICAM-1基因沉默組受到輻照后損傷程度降低，

10、增殖活性及恢復(fù)能力均比對照組增強;流式凋亡結(jié)果顯示ICAM-1基因沉默組細胞受到輻照后24h、48h細胞凋亡率均比對照組小，且48h后恢復(fù)情況也較對照組好，輻照24h后的細胞周期G2/M期比例明顯增加，48h后比例有所下降但仍比未輻照組高，提示與細胞凋亡結(jié)果相一致。
　　 [結(jié)論]
　　 1.在16Gy60Coγ射線照射建立的小鼠放射性肺損傷模型中研究發(fā)現(xiàn)，肺組織中ICAM-1蛋白存在異常表達，且與TGF-β1、TNF-

11、α的表達變化相一致。提示ICAM-1的表達水平的高低可能與放射性肺損傷具有一定的相關(guān)性，且與TGF-β1、TNF-α等細胞因子存在相互作用，可作為預(yù)測或評價放射性肺損傷程度的一個重要因子。
　　 2.靶向 ICAM-1基因的重組質(zhì)粒載體pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA構(gòu)建成功，為建立ICAM-1基因沉默細胞株及后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 3.成功構(gòu)建ICAM-1基因沉默細胞株，沉默細胞株的生物特性研究提

12、示ICAM-1可能參與細胞增殖等生理活動。
　　 4.利用基因芯片技術(shù)分析ICAM-1基因沉默后全基因組表達譜的變化，發(fā)現(xiàn)ICAM-1可能通過Bax/Bcl-2、FasL/Fas、MAPK等通路參與細胞增殖、凋亡等生理過程。
　　 5.在ICAM-1在照射后LLC細胞株中的作用機制研究試驗結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)干擾ICAM-1基因的表達，可以明顯降低LLC細胞株的輻射敏感性，增強輻射損傷后的恢復(fù)力。提示ICAM-1在放射性肺損傷中