Draxin在正常小鼠觸須毛囊的表達(dá)及對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用.pdf

1、目的:觸須是毛發(fā)的一種，其生長(zhǎng)和脫落經(jīng)歷生長(zhǎng)期、衰退期和靜止期的周期性變化，稱之為毛囊周期。毛囊是復(fù)雜微小器官，主要包括毛球、結(jié)締組織根鞘、外根鞘、內(nèi)根鞘、毛根和毛干。胚胎時(shí)期毛囊的形成，以及出生后毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)的周期性變化，是真皮-表皮細(xì)胞相互作用的結(jié)果。真皮毛乳頭細(xì)胞分泌多種活性蛋白和細(xì)胞因子，誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞增殖、分化，導(dǎo)致毛囊周期各個(gè)階段形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。Draxin是新近發(fā)現(xiàn)的軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，排斥聯(lián)合

2、神經(jīng)元軸突從背側(cè)到腹側(cè)的投射。DCC是draxin的受體，在毛囊表皮干細(xì)胞高度表達(dá)，因此本實(shí)驗(yàn)探討draxin是否在毛乳頭部位表達(dá)并參與毛囊周期各階段毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)變化調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HE染色、免疫熒光和拔毛后觸須生長(zhǎng)長(zhǎng)度檢測(cè)等技術(shù)，觀察正常小鼠觸須毛囊周期各階段毛囊結(jié)構(gòu)的變化、draxin在毛囊內(nèi)的分布情況以及不同類型小鼠拔毛后觸須生長(zhǎng)長(zhǎng)度的不同，初步探討draxin在正常小鼠觸須毛囊內(nèi)的表達(dá)及其對(duì)觸須生長(zhǎng)可能的調(diào)控作用。
　　方

3、法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組:選用健康雌性的7-8周齡清潔級(jí)野生型小鼠(draxin+/+)和draxin基因敲除型小鼠(draxin-/-)共42只(draxin基因敲除型小鼠由日本熊本大學(xué)田中英明教授友情饋贈(zèng))。把36只野生型小鼠隨機(jī)分成6組，每組6只。其中五組分別為拔毛后5天組、10天組、16天組、20天組和25天組;剩下一組作為對(duì)照組和6只draxin-/-小鼠進(jìn)行拔毛后若干時(shí)間點(diǎn)觸須生長(zhǎng)長(zhǎng)度對(duì)比，所有動(dòng)物均在符合清潔標(biāo)準(zhǔn)

4、的實(shí)驗(yàn)室(T22-25℃，濕度50-70％)常規(guī)喂養(yǎng)。
　　2.毛囊周期同步化的建立:根據(jù)Paus等的方法選用7-8周齡雌性draxin+/+和draxin-/-小鼠。用松蠟合劑進(jìn)行脫毛，一次未拔凈者，重復(fù)此過程，直至觸須完全拔凈為止，脫毛當(dāng)天為毛發(fā)周期第0天。
　　3.實(shí)驗(yàn)組織的獲取:選取拔毛后5天、10天、16天、20天、25天野生型小鼠，腹腔注射1％戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉，斷頸處死。用小鑷子夾起觸須部皮膚，用

5、剪刀剪開皮膚，取大小約1cm×1cm皮膚。迅速在0.1MPBS緩沖液中清洗，然后平鋪在濾紙片上，將其放入4％的多聚甲醛中，冰上搖床搖晃固定3小時(shí)，然后放入30％蔗糖中，4℃過夜，第二天用小鑷子固定皮膚，用手術(shù)刀片順著觸須排列的方向?qū)⑵つw切成小塊，將其放入盛有O.C.T的四孔板中，放入時(shí)將修好的一面朝下放正，迅速放入-80℃冰箱，待其凝固后保存或使用。
　　4.冰凍切片的制備、HE及免疫熒光染色:取出的組織塊，將其固定在冰凍切片機(jī)上

6、，順著毛囊的方向進(jìn)行連續(xù)切片，片厚10um;然后將其貼于防脫粘附載玻片上，37℃恒溫烤片機(jī)上烤片30分鐘。HE染色觀察野生型小鼠拔毛后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)毛囊形態(tài)學(xué)上的改變;免疫熒光技術(shù)檢測(cè)draxin在毛囊內(nèi)的表達(dá)情況。
　　5.拔毛后觸須生長(zhǎng)長(zhǎng)度檢測(cè):用奧林巴斯全能顯微鏡對(duì)野生型小鼠和draxin基因敲除型小鼠進(jìn)行觸須部位圖像采集，測(cè)量觸須生長(zhǎng)長(zhǎng)度。開始觸須較短時(shí)，用顯微鏡上的標(biāo)尺測(cè)量，長(zhǎng)到一定長(zhǎng)度后，用直尺測(cè)量。對(duì)比野生型小鼠與dra

7、xin基因敲除型小鼠拔毛后5天、10天、16天、20天、25天觸須長(zhǎng)度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.HE染色:拔毛后5天可見:毛乳頭近似圓形，由膨大的毛球完全包繞。黑色素顆粒沉積在毛球和內(nèi)根鞘基底部。新毛根較短，沒有到達(dá)皮脂腺部位。舊毛根位于新毛根上方，沒有完全脫落。拔毛后10天可見:新毛根向上生長(zhǎng)到達(dá)皮脂腺部位或超越皮脂腺，部分毛囊仍可見沒有完全脫落的舊毛根，但比拔毛后5天更接近皮膚。拔毛后16天可見:毛乳頭和毛

8、球變狹窄，黑色素顆粒減少，新毛根頂端到達(dá)皮膚表面。拔毛后20天可見:毛乳頭被毛球部分包繞，毛囊長(zhǎng)度縮短，毛根與毛球、內(nèi)根鞘脫離，毛囊變短并向上回縮。拔毛后25天可見:毛乳頭從毛球中徹底分離出來，位于毛球下方，毛囊繼續(xù)向上回縮，接近皮脂腺部位。
　　2.免疫熒光:拔毛后5天，draxin在毛乳頭內(nèi)有較強(qiáng)表達(dá);拔毛后10天，draxin在毛乳頭內(nèi)表達(dá)增強(qiáng);拔毛后16天，draxin在毛乳頭內(nèi)表達(dá)開始減弱;拔毛后20天和25天，drax

9、in在毛乳頭內(nèi)表達(dá)微弱。拔毛后5天，draxin在結(jié)締組織根鞘內(nèi)有強(qiáng)表達(dá)，但拔毛后10天，16天，20天和25天draxin在結(jié)締組織根鞘內(nèi)表達(dá)微弱。此外，毛球、外根鞘、內(nèi)根鞘和毛根等處，在拔毛后各個(gè)時(shí)期內(nèi)均未見draxin表達(dá)。
　　3.拔毛后觸須生長(zhǎng)長(zhǎng)度檢測(cè):拔毛后5天、10天、16天、20天和25天野生型小鼠新生觸須的長(zhǎng)度，除拔毛后5天兩型小鼠觸須未長(zhǎng)出外，均較draxin基因敲除型小鼠新生觸須的長(zhǎng)度短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<