利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建FGF21基因敲除小鼠及其對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用研究.pdf

1、小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(Fibroblast growth factor21，F(xiàn)GF21)基因是FGF家族的一員，F(xiàn)GF21是最新發(fā)現(xiàn)和毛囊發(fā)育有關(guān)的因子，其功能可能是在次級(jí)毛囊發(fā)育中促進(jìn)轉(zhuǎn)變成退行期，因此推測(cè)該基因缺失或突變能夠促進(jìn)毛囊發(fā)育。CRISPR-Cas9是一種原核生物通過(guò)gRNA介導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)外源DNA進(jìn)行切割的基因修飾技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)通過(guò)顯微注射法制作FGF21基因全身性敲除小鼠。通過(guò)脫毛

2、實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的長(zhǎng)毛速度;通過(guò)石蠟切片檢測(cè)小鼠皮膚毛囊的直徑和數(shù)量;通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR與Western blot技術(shù)檢測(cè)了FGF21基因敲除后小鼠皮膚中與毛囊發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　1.gRNA表達(dá)載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建
　　根據(jù)FGF21基因的編碼序列(CDs)，用麻省理工學(xué)院的CRISPRDesign軟件(http://crispr.mit.edu/)設(shè)計(jì)4對(duì)長(zhǎng)20nt的gRNA，以gRNA-T2為模板進(jìn)行體外擴(kuò)增，得到完

3、整的gRNA，其最終PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為455bp。
　　用構(gòu)建好的4個(gè)gRNA和hCas9共同轉(zhuǎn)染小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，設(shè)計(jì)跨靶位點(diǎn)的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用Surveyor突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，從中篩選出敲除效率較高的2個(gè)gRNA，以備用于顯微注射法制備FGF21基因全身性敲除小鼠。
　　2.利用顯微技術(shù)制備FGF21敲除小鼠
　　通過(guò)顯微注射法將FGF21-gRNA和Cas9 mRNA混合物注射到小鼠胞質(zhì)中。

4、注射340枚胚胎后得到63只新生小鼠，其中有15只雜合小鼠和3只純合敲除小鼠，總突變率為28.6％。
　　3.FGF21基因敲除小鼠的檢測(cè)
　　利用脫毛實(shí)驗(yàn)、石蠟切片、實(shí)時(shí)定量PCR、Western Blot技術(shù)檢測(cè)基因敲除小鼠和野生型小鼠。觀察脫毛實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，敲除小鼠長(zhǎng)毛速度相對(duì)慢且體表沒(méi)有長(zhǎng)出被毛。石蠟切片結(jié)果顯示敲除小鼠毛囊直徑變小，毛囊數(shù)量減少。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，敲除小鼠體內(nèi)F