典型醛類(lèi)污染物與DNA形成加合物的機(jī)制及檢測(cè)方法.pdf

1、DNA加合物是化學(xué)毒物經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后的親電活性產(chǎn)物與DNA分子形成的共價(jià)結(jié)合物，它既是一種暴露標(biāo)志物，又是一種效應(yīng)標(biāo)志物，能綜合反映生物體對(duì)化學(xué)毒物(致癌物)的暴露、吸收、分布、代謝以及機(jī)體對(duì)DNA的修復(fù)能力。研究醛類(lèi)污染物與DNA形成加合物的機(jī)制，建立DNA加合物檢測(cè)新方法對(duì)DNA加合物的研究具有重要意義。　　在DNA加合物的形成機(jī)制研究方面，作者用紫外分光光度法和共振光散射法研究了醛類(lèi)污染物與DNA的作用，結(jié)果表明：(1)在體外試管

2、測(cè)試體系中，甲醛、乙醛與ctDNA作用，DNA的256nm處的紫外吸收峰發(fā)生紅移(+)，且存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系；首次發(fā)現(xiàn)甲醛或乙醛與小牛胸腺DNA作用后也能引起DNA218nm處紫外吸收峰的紫移，最大位移為16nm(-)。由此初步推斷甲醛或乙醛能夠加合到小牛胸腺DNA的親核位點(diǎn)，引起了具有紫外吸收官能團(tuán)的改變，形成了醛類(lèi)-DNA加合物；(2)首次用共振光散射法研究了甲醛與DNA的相互作用。實(shí)驗(yàn)表明，在ctDNA-SDBS-JG體系中

3、加入甲醛后，600nm附近的共振光散射峰發(fā)生明顯的位移，共振光散射強(qiáng)度與甲醛加入量在0～0.34mol/L范圍內(nèi)成良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程為：I=2.99c+311.3，r=0.994?？捎帽痉▉?lái)定性估計(jì)DNA加合物的形成量，并可用該法測(cè)定環(huán)境中的甲醛污染物的含量。實(shí)驗(yàn)還表明，SDBS、JG對(duì)甲醛與DNA的相互結(jié)合反應(yīng)可能存在協(xié)同作用，即甲醛與DNA堿基作用形成加合物可能存在活化過(guò)程，即體內(nèi)的帶電荷的離子或極性分子誘導(dǎo)甲醛羰基的極化

4、，促使甲醛聚集到DNA分子表面上，然后，其中部分嵌入到DNA堿基對(duì)中與DNA作用形成加合物。本文建立的共振光散射法可用于DNA加合物形成機(jī)制的研究；(3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)資料綜合分析，提出了典型醛類(lèi)污染物與DNA形成加合物的可能機(jī)制：典型醛類(lèi)污染物在體內(nèi)帶電離子或極性分子的作用下，羰基極化或羰基氧原子與體內(nèi)代謝所產(chǎn)生的H+結(jié)合，形成親電活性分子，然后進(jìn)攻DNA嘌呤堿基上的伯氨基(-NH2)或嘧啶堿基上的仲胺基(-NH-)形成Schif

5、f's堿，Schiff's堿不穩(wěn)定，在體內(nèi)還原體系的作用下，形成穩(wěn)定的DNA加合物；甲醛與DNA形成的加合物可能是N2-羥甲基-脫氧鳥(niǎo)苷加合物、N6-羥甲基-脫氧腺苷加合物；典型醛類(lèi)污染物與DNA作用還可引起DNA-DNA交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等作用。甲醛、乙醛與ctDNA作用后紫外吸收峰發(fā)生紫移，可能是醛類(lèi)物質(zhì)引起DNA的堿基之間交聯(lián)，而部分破壞了堿基芳雜環(huán)的共軛體系所致；在體內(nèi)的復(fù)雜體系中可能還存在其它作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。在

6、DNA加合物檢測(cè)方面，初步建立了一種基于熒光猝滅法檢測(cè)DNA加合物的新方法：(1)根據(jù)ATP在pH7.0的Tris-HCl溶液中對(duì)HSA熒光的猝滅效應(yīng)，建立了一種檢測(cè)ATP的新方法，在實(shí)驗(yàn)最適條件下，ATP濃度在1.70～42.37μg/mL范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系(r=0.9991)；方法檢出限1.70μg/mL；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.7％～1.36％；樣品加標(biāo)回收率95％～101％；(2)利用特異的核酸酶消化DNA樣品，加合物最終以二聚核苷

7、酸(XpN)的形式存在，在T4多聚核苷酸激酶(PNK)的作用下，將ATP的γ位磷酸轉(zhuǎn)移標(biāo)記到XpN的5'端，樣品中加合物的含量與ATP的消耗量成正比，利用新建立的血清白蛋白熒光猝滅法準(zhǔn)確檢測(cè)ATP的消耗量，根據(jù)ATP的消耗量確定加合物的含量。同時(shí)用六聚寡核苷酸(GACTCA)作為加合物標(biāo)準(zhǔn)，繪制校準(zhǔn)曲線(xiàn)，初步建立了一種新的DNA加合物檢測(cè)方法。并用本方法分析測(cè)定了甲醛與ctDNA形成的DNA加合物，靈敏度可達(dá)1個(gè)加合物/106正常核苷酸