TNF-α通過激活NF-κB和MAPK途徑上調(diào)表達Snai2誘導MCF-7細胞發(fā)生EMT和侵襲遷移.pdf

1、目的：探討TNF-α誘導乳腺癌MCF-7細胞發(fā)生EMT和增強該細胞的侵襲能力，并對其分子機制進行研究。
　　方法：(1)TNF-α刺激MCF-7細胞6天后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變，Western blot檢測細胞中E-cadherin和vimentin蛋白含量變化，Transwell實驗檢測細胞侵襲能力改變，real-time PCR檢測細胞MMP-9基因表達水平。(2)TNF-α刺激MCF-7細胞0，15分鐘，30分鐘，6

2、0分鐘和6天，Western blot檢測NF-κB和MAPK途徑中相關分子的磷酸化狀態(tài)；TNF-α刺激6天的MCF-7細胞分別加/不加各途徑的抑制劑，采用上述(1)中的方法檢測MCF-7細胞 E-cadherin和vimentin的表達、細胞的侵襲能力及MMP-9基因表達。(3) TNF-α刺激MCF-7細胞6天后，檢測轉(zhuǎn)錄因子Snai1，Snai2，Twist1，ZEB1基因mRNA表達；分別使用各途徑的抑制劑后，Western b

3、lot檢測Snai2蛋白含量變化。(4)用Snai2 shRNA慢病毒載體感染MCF-7細胞，并沉默Snai2，觀察Snai2在TNF-α誘導MCF-7細胞發(fā)生EMT和侵襲能力中的作用。
　　結(jié)果：(1)TNF-α長時間刺激MCF-7細胞，細胞由鵝卵石樣變成梭型細胞形態(tài)，MCF-7細胞E-cadherin蛋白含量降低，vimentin蛋白含量增加，呈現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特性；MCF-7細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)顯著增加；MM

4、P-9 mRNA表達上調(diào)。(2)TNF-α無論是短時間還是長時間刺激MCF-7細胞，NF-κB和MAPK途徑中相關分子IκB、p38、ERK1/2、JNK磷酸化水平增加，而非磷酸化的IκB、p38、ERK1/2和JNK含量無明顯改變；分別使用MAPK和NF-κB途徑的抑制劑后，E-cadherin表達上調(diào)，而vimentin表達下降；MCF-7細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)顯著減少；MMP-9 mRNA表達下調(diào)。(3)TNF-α

5、長時間刺激MCF-7細胞能誘導Snai2 mRNA水平和蛋白水平表達上調(diào)，但對Snai1，Twist1和ZEB1基因表達沒有影響。分別使用MAPK和NF-κB途徑的抑制劑后，發(fā)現(xiàn)除了JNK抑制劑外，其他抑制劑都使Snai2蛋白含量降低。(4)Snai2 shRNA沉默Snai2基因后，細胞內(nèi)E-cadherin含量增加，vimentin含量減少，細胞侵襲能力下降，MMP-9基因表達下調(diào)。
　　結(jié)論：TNF-a長時間刺激能誘導MCF