TNF-α、NF-κB誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及雷帕霉素干預(yù)影響.pdf

1、近年來，隨著胰島素治療應(yīng)用于臨床，糖尿病急性并發(fā)癥的死亡率明顯減少，而糖尿病慢性并發(fā)癥成為糖尿病患者致死，致殘的主要原因，其中糖尿病腎?。―N）是最主要的原因之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在糖尿病腎病發(fā)病中也起著重要作用，體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，人和動(dòng)物體內(nèi)均證實(shí)高糖狀態(tài)下腎細(xì)胞凋亡增多，但機(jī)理尚不清楚。已有許多實(shí)驗(yàn)和臨床資料均提示糖尿病往往存在炎細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)水平上升，浸潤的單核/巨噬細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子，炎癥介質(zhì)及產(chǎn)生氧自由基等

2、造成腎組織結(jié)構(gòu)的破壞，加速腎小球硬化的進(jìn)程，故炎癥可能或作為上述機(jī)制的下游環(huán)節(jié)在糖尿病腎病損害的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。NF-kB是具有多向性調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)分子，能與多種細(xì)胞基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中的kB序列位點(diǎn)特異結(jié)合，參與基因表達(dá)的調(diào)控，在炎癥、應(yīng)激反應(yīng)及免疫調(diào)控中起重要作用。TNF-α是由單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生的多效的多肽類細(xì)胞因子，可以通過NF-kB來誘導(dǎo)其表達(dá)，也可以通過自分泌和旁分泌來調(diào)節(jié)自身及其它因子的表達(dá)

3、，對腎臟產(chǎn)生潛在的損害作用。兩因子是否參與了糖尿病腎臟細(xì)胞凋亡作用、抑制NF-kB的活化是否可以減輕炎癥反應(yīng)從而減少糖尿病腎臟細(xì)胞的凋亡和壞死，尚不清楚。雷帕霉素是一種療效好、低毒、無腎毒性的新型免疫抑制劑。近來研究表明雷帕霉素可抑制NF-kB的活化從而抑制某些細(xì)胞因子（如TNF-α等）和趨化因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。但雷帕霉素抑制NF-kB的活化干預(yù)糖尿病腎臟細(xì)胞凋亡方面的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此本研究擬應(yīng)用公認(rèn)的2型糖尿病模型來

4、觀察糖尿病腎組織腫瘤壞死因子α（TNF-α）、核因子-kB（NF-kB）的表達(dá)及其與腎組織細(xì)胞凋亡關(guān)系以及雷帕霉素的干預(yù)作用，探討NF-kB和TNF-α促凋亡作用及雷帕霉素其可能的保護(hù)機(jī)制，從而為糖尿病腎病提供一種能有效延緩和治療DN一個(gè)有潛力的藥物。
　　 研究目的：
　　 觀察糖尿病腎組織腫瘤壞死因子α（TNF-α）、核因子-kB（NF-kB）的表達(dá)及其與腎組織細(xì)胞凋亡關(guān)系以及雷帕霉素對其的影響。
　　 研究

5、方法：
　　 于清醒狀態(tài)下尾尖取全血，采用美國強(qiáng)生血糖儀在3pm時(shí)測定大鼠血糖值。以餐后（2h）血糖≥11.1mmol/L或空腹血糖（饑餓8小時(shí)）≥7.8mmol/L作為2型糖尿病的判斷標(biāo)準(zhǔn)。成模后隨機(jī)抽取10只GK大鼠為藥物干預(yù)組，10只為糖尿病對照組，另取10只Wistar雄性大鼠作為正常對照組，即如下3組：對照組（NC組，n=10只）、雷帕霉素治療組（DMR組，n=10只）和糖尿病組（DM組，n=10只）。實(shí)驗(yàn)組給予雷帕霉

6、素6mg/Kg，一周三次。正常對照組和糖尿病組給予等劑量生理鹽水，均為灌胃給藥。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中未給予胰島素降血糖治療。4周及8周接24小時(shí)尿，測測定24h尿白蛋白總量、尿β2-微球蛋白，處死后取血測定血糖、血甘油三酯、血總膽固醇。TUNEL法檢測腎組織細(xì)胞凋亡。免疫組織化學(xué)法檢測腎組織TNF-α和NF-kB的表達(dá)。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、三組間的血糖、血甘油三酯、血總膽固醇的變化情況（見表1）：DM組大鼠的血糖明顯

7、高于NC組（（P<0.05），DMR組大鼠的血糖水平低于DM組（P<0.05）；DM組大鼠血TG水平明顯高于NC大鼠（（P<0.05），雷帕霉素對GK大鼠血TC、TG水平無影響，三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2、各組大鼠24h尿白蛋白（ALB）及尿β2-微球蛋白（尿β2-MG）比較（見表2）：各組大鼠與正常對照組相比，ALB均增加，并具有顯著性差異（P<0.05），而雷帕霉素治療組具有明顯的減少白蛋白的作用。同樣，尿β2-MG在

8、經(jīng)過治療后也有一定的減少。
　　 3、正常及糖尿病組TUNEL法檢測大鼠腎組織細(xì)胞凋亡結(jié)果（見表三，圖1）：正常對照組凋亡細(xì)胞很少見；4w及8w DM組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸增多與正常對照組比較，DM組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡增多，且隨病程延長凋亡細(xì)胞數(shù)呈增多趨勢（P<0.01）。
　　 4、正常及糖尿病組NF-kBp65免疫組化結(jié)果：NF-kBp65陽性表達(dá)特征為腎臟內(nèi)細(xì)胞核或胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒。正常各組腎小球和腎小管可見

9、NF-kBp65少許陽性表達(dá)，主要分布在腎小管；4w DM組大鼠腎組織中NF-kBp65陽性表達(dá)增多，8w后DM組大鼠腎組織NF-kBp65明顯表達(dá)，見圖2。半定量分析結(jié)果顯示，DM組大鼠腎組織NF-kBp65即顯著增高（P<0.01），4w DM組大鼠腎組織NF-kBp65顯著高于NC組及DM組（P<0.01），8w后DM組大鼠則進(jìn)一步增高，顯著高于DM組及4w DM組（均P<0.01），見表3。
　　 5、正常及糖尿病組TN

10、F-α免疫組化結(jié)果：NC組大鼠腎組織TNF-α可有輕微陽性表達(dá)；4w DM組大鼠腎組織中TNF-α陽性表達(dá)增多，8w后DM組大鼠腎組織TNF-α明顯表達(dá)，見圖3。半定量分析結(jié)果顯示，4w，8w DM組大鼠腎組織TNF-α表達(dá)有逐漸上升的趨勢，均顯著高于NC組（均P<0.01），見表3。
　　 6、正常及糖尿病組腎組織NF-kBp65、TNF-α的表達(dá)及與腎組織細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性：NF-kBp65、TNF-α陽性表達(dá)呈正相關(guān)（r

11、=0.956，P<0.01）；NF-kBp65、TNF-α陽性表達(dá)率與病程呈正相關(guān)；腎組織TNF-α表達(dá)與腎組織細(xì)胞凋亡之間呈正相關(guān)（r=0.953，P<0.01）；腎組織NF-kBp65表達(dá)與腎組織細(xì)胞凋亡之間亦呈正相關(guān)（r=0.886，P<0.01）；見表3。
　　 7、雷帕霉素對糖尿病大鼠腎組織細(xì)胞凋亡、NF-kBp65、TNF-α表達(dá)的影響：DMR組，與DM組比較，4w、8w DMR組腎組織TNF-α和NF-kBp65的

12、過度表達(dá)均被顯著抑制（均P<0.01），4w及8w DMR組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡數(shù)目減少。
　　 結(jié)論：
　　 在本試驗(yàn)條件下：
　　 （1）雷帕霉素可降低2型糖尿病大鼠血糖，改善24h尿白蛋白（ALB）及尿β2-MG的排泄；糖尿病腎病發(fā)展過程中細(xì)胞數(shù)目的減少，至少部分是通過細(xì)胞凋亡機(jī)制引起；
　　 （2）NF-kB及其誘導(dǎo)的TNF-α在糖尿病腎病損傷中發(fā)揮重要作用；
　　 （3）雷帕霉素可能通過抑