環(huán)維黃楊星D對(duì)大鼠在體回腸的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的： 探討中藥單體環(huán)維黃楊星D（CVB-D）對(duì)大鼠在體回腸的作用，并進(jìn)一步從細(xì)胞水平上探討其作用機(jī)制。 方法： 1.經(jīng)十二指腸插管給予不同濃度的CVB-D，利用BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)觀察CVB-D對(duì)大鼠在體回腸收縮幅度及頻率的影響，并預(yù)先給予鈣通道阻滯藥硝苯地平以初步推斷CVB-D對(duì)大鼠在體回腸的作用機(jī)制。 2.采用混合酶法（膠原酶、鏈霉蛋白酶E、牛血清白蛋白）分離培養(yǎng)大鼠回腸平滑肌細(xì)胞，繪制原代

2、培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并利用平滑肌肌動(dòng)蛋白α-actin免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行鑒定。 3.利用MTT比色法測(cè)定CVB-D對(duì)大鼠回腸平滑肌細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)液的LDH檢測(cè)CVB-D的細(xì)胞毒性。 4.應(yīng)用鈣敏感的熒光指示劑Fura-2，于熒光分光光度計(jì)上測(cè)定CVB-D作用后平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度（[Ca2+]i），從細(xì)胞水平上探討CVB-D的作用機(jī)制。 結(jié)果： 1.與生理鹽水組比較，CVB-D

3、低、中、高劑量組在給藥110min后大鼠回腸的收縮幅度增強(qiáng)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)收縮幅度升高更為顯著（P<0.05），并且各組藥物之間具有劑量依賴性；而預(yù)先給予鈣通道阻滯藥硝苯地平可拮抗其對(duì)回腸的收縮作用（P<0.05）； CVB-D對(duì)回腸的收縮頻率無(wú)顯著影響（P>0.05）。 2.新鮮分離的回腸平滑肌細(xì)胞呈長(zhǎng)短不一的梭形或橢圓形，細(xì)胞培養(yǎng)48h后，可見(jiàn)細(xì)胞已貼壁，3～5d細(xì)胞開(kāi)始增殖，10 d后細(xì)胞密集，呈峰谷樣生長(zhǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)成致密單

4、層時(shí)即可傳代。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：大部分多角形細(xì)胞胞漿內(nèi)見(jiàn)棕色及淺棕色細(xì)顆粒，呈陽(yáng)性反應(yīng)，核不著色，呈淺藍(lán)色?？梢?jiàn)培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞純度較高，幾無(wú)成纖維細(xì)胞混雜。 3.MTT測(cè)定顯示，低、中劑量CVB-D對(duì)平滑肌細(xì)胞有明顯的促進(jìn)增殖作用（P<0.01），而高劑量CVB-D則抑制細(xì)胞的增殖（P<0.05）。細(xì)胞培養(yǎng)液的LDH檢測(cè)結(jié)果顯示，低、中劑量CVB-D組LDH明顯低于空白對(duì)照組（P<0.01），提示CVB-D對(duì)細(xì)胞有保護(hù)

5、作用，而高劑量組LDH明顯高于對(duì)照組（P<0.01），提示過(guò)高濃度CVB-D會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷或促進(jìn)凋亡。 4.當(dāng)回腸平滑肌細(xì)胞懸液細(xì)胞外鈣（[Ca2+]o）為1.5mmol/L時(shí)，CVB-D可誘發(fā)靜息期[Ca2+]i升高，而預(yù)先給予維拉帕米可以抑制[Ca2+]i的升高，抑制率為17.9%；當(dāng)[Ca2+]o為0mmol/L時(shí)，CVB-D仍可使[Ca2+]i升高，而普魯卡因?qū)Ca2+]i升高的抑制率達(dá)29.2%。 結(jié)論：