NF-κB及其下游抗凋亡因子在膽道損傷愈合過(guò)程中的表達(dá)的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的:組織損傷愈合是一個(gè)由眾多細(xì)胞、細(xì)胞因子、信號(hào)蛋白以及相關(guān)基因所參與的龐大反應(yīng)體系,不同組織因內(nèi)環(huán)境的差異會(huì)出現(xiàn)不同的愈合結(jié)局,而膽道獨(dú)特的生理解剖學(xué)特點(diǎn)造成其瘢痕形式的愈合轉(zhuǎn)歸,瘢痕的攣縮將導(dǎo)致膽道良性狹窄的發(fā)生,繼而膽汁排泄甚至分泌受阻,發(fā)生梗阻,從而引起臨床上一系列的癥狀,最終造成膽道感染,膽汁性肝硬化,肝衰竭等結(jié)局。本課題擬建立犬膽道損傷愈合模型,通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察膽管損傷修復(fù)瘢痕形成過(guò)程中核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear Fact

2、or Kappa B,NF-κB)激活情況及其下游凋亡調(diào)控蛋白:凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis protein-1,cIAP-1),FIACE樣抑制蛋白(FLICE-like inhibitoryprotein,c-FLIP)及其下游凋亡因子caspase3、8的表達(dá)及定位情況,從凋亡增殖平衡角度闡述膽道損傷愈合瘢痕形成機(jī)制,為臨床找到治療膽道良性狹窄的新方法提供思路。
　　 方法

3、:選取本地健康雜交犬30只,隨機(jī)(數(shù)字表法)分為實(shí)驗(yàn)組(n=15),對(duì)照組(n=15),每組再分為2月,3月,4月,5月,6月組。建立犬膽管損傷模型,采用電刀全層切開(kāi)膽總管前、側(cè)壁,保留后壁,然后均行粘膜對(duì)粘膜全層縫合,對(duì)照組游離膽總管后關(guān)腹。分別于術(shù)后各小組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取膽管吻合口組織,以免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)NF-κ3激活情況,c-FLIF蛋白及caspase3、8的表達(dá)及定位情況,用原位雜交法檢測(cè)cLAP-1及c-FLIFmRNA表

4、達(dá)情況。利用圖像分析系統(tǒng)定量分析兩組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及定位,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較。
　　 結(jié)果:1.NF-κB于實(shí)驗(yàn)組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)均有明顯激活(37.52±4.33～50.41±4.17),較對(duì)照組(8.68±0.78～10.17±1.27)有顯著性差異(P<0.05),主要定位于間質(zhì)細(xì)胞,以成纖維細(xì)胞為甚；各時(shí)相間總體有顯著性差異(P<0.05),其中以3月組最為強(qiáng)烈(50.41±4.17％):5月組與2,3月,6月組與2,3,4

5、月組均有差異(P<0.05)。2.實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相的間質(zhì)組織中cFLIPmRNA均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),以纖維細(xì)胞胞漿表達(dá)為主,而腺體組織很少表達(dá)或幾乎無(wú)表達(dá):在相應(yīng)時(shí)相的間質(zhì)組織中(24.76±4.52～30.57±6.17)的表達(dá)明顯強(qiáng)于在腺體組織中(3.27±1.17～3.83±1.04)的表達(dá)(P<0.05)；在間質(zhì)組織或腺體組織中cFLIPmRNA表達(dá)在不同時(shí)相之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組各時(shí)相的間質(zhì)組織和腺體組織中均

6、呈弱表達(dá)；在相應(yīng)時(shí)相的間質(zhì)組織(3.19±0.70～3.95±1.10)和腺體組織中(3.44±0.59～3.78±0.71)cFLIPmRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；間質(zhì)組織或腺體組織中cFLIPmRNA表達(dá)在不同時(shí)相之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。cFLIPmRNA在實(shí)驗(yàn)組的間質(zhì)組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)時(shí)相的假手術(shù)組(P<0.05)；而cFLIPmRNA在腺體組織中的表達(dá)兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05)。3

7、.c-FLIP蛋白于實(shí)驗(yàn)組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)均呈陽(yáng)性表達(dá),定位于間質(zhì)細(xì)胞,以成纖維細(xì)胞為主,各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)實(shí)驗(yàn)組(17.23±3.53～22.33±3.40)與對(duì)照組(3.11±1.01～3.41±0.69)比較有顯著性差異(P<0.05)；而各時(shí)間點(diǎn)之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。caspase8于實(shí)驗(yàn)組(3.20±0.86～4.01±0.88)各時(shí)相均呈現(xiàn)弱表達(dá),定位以腺上皮居多,間質(zhì)組織表達(dá)相對(duì)較弱,與配對(duì)之對(duì)照組(10.03±1.93～1

8、1.66±2.80)比較差異顯著(P<0.05)；而各時(shí)間點(diǎn)之間亦無(wú)顯著性差異(P>0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果:發(fā)現(xiàn)c-FLIP與caspase8蛋白表達(dá)成負(fù)相關(guān)(P<0.01,r=-0.94)。4.實(shí)驗(yàn)組cIAP1mRNA于各時(shí)間點(diǎn)均強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(25.85±6.61～36.85±4.21),與對(duì)照組(2.68±1.05～3.10±1.00)差異明顯(P<0.05),定位于間質(zhì)細(xì)胞,以成纖維細(xì)胞最為明顯；各時(shí)間點(diǎn)間無(wú)顯著性差異(P>0.

9、05)。實(shí)驗(yàn)組Caspase3表達(dá)(2.65±0.60～4.37±0.62)明顯弱于對(duì)照組(10.15±2.06～11.96±3.69)(P<0.05),腺上皮表達(dá)相對(duì)較強(qiáng),各期之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。且cIAP-1mRNA與caspase3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01,r=-0.95)。
　　 結(jié)論:膽道(肌)成纖維細(xì)胞NF-κB的激活及其下游凋亡調(diào)控蛋白cIAP-1,c-FLIP的表達(dá)可能分別通過(guò)抑制終端凋亡執(zhí)行蛋