小鼠皮膚燙傷愈合過程中轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子1表達(dá)的研究.pdf

1、目的：
　　 皮膚損傷愈合是一個(gè)連續(xù)而又復(fù)雜的生理過程,其大致可分為三個(gè)階段:急性滲出期、纖維增生期和組織重建期。在急性滲出期,各種類型的炎癥細(xì)胞,例如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,浸潤到損傷區(qū)域參與清除損傷壞死組織、異物及入侵的病原體等。在纖維增生期,肌成纖維細(xì)胞主要參與損傷組織的修復(fù)。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí),在皮膚損傷愈合過程中有各種各樣的細(xì)胞因子、生長因子和趨化因子的參與。皮膚燙傷是一種很嚴(yán)重的損傷,可以產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS),R

2、OS誘發(fā)組織破壞并且可以激活Nrf1。Nrf1屬于亮氨酸拉鏈家族核轉(zhuǎn)錄因子成員,此家族還有Nrf2和Nrf3等因子。Nrf1通過與抗氧化作用元件結(jié)合,介導(dǎo)抗氧化保護(hù)基因和二相解毒酶基因的活化。到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)Nrf1在皮膚燙傷愈合過程中的研究。本實(shí)驗(yàn)首次研究小鼠皮膚燙傷愈合過程中不同損傷時(shí)間段Nrf1的表達(dá)和分布情況,探討Nrf1在皮膚損傷愈合過程中的作用及其應(yīng)用于損傷時(shí)間推斷的可能性。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　

3、　 健康成年雄性昆明系小鼠60只,體質(zhì)量35～40g,隨機(jī)分為12組。其中11組為皮膚燙傷組,另1組為對照組。腹腔注射戊巴比妥鈉,背部剪毛處理后,在背部中央做一直徑為1cm的圓形燙傷區(qū)域。傷后每只小鼠單籠飼養(yǎng),防止感染,保持12h的晝夜交替生活節(jié)律。分別于傷后3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d、17d和21d將小鼠麻醉后脫頸椎處死,取傷口處2.0cm×2.0cm皮膚組織。各組5只小鼠,皮膚樣本均分為兩部分,一部

4、分用于HE染色、Masson染色、免疫組化染色和免疫熒光染色,另一部分用于Westernblot和qReal-timeRT-PCR(Real-timePCR)檢測。對照組5只小鼠麻醉后背部剪毛,不做燙傷,取相同部位同等大小皮膚。應(yīng)用免疫組化、免疫熒光,Westernblot及Real-timePCR技術(shù)檢測小鼠皮膚燙傷后不同時(shí)間Nrf1表達(dá)變化情況,以未燙傷小鼠皮膚組織作對照,顯微鏡×400倍下,在損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)視野,

5、計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)、陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算陽性細(xì)胞率。應(yīng)用Scionimage軟件測各片段的平均光密度值,測得數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。應(yīng)用Real-time7500系統(tǒng)進(jìn)行熒光數(shù)值自動分析。用SPSS13.0forWindows進(jìn)行單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 小鼠皮膚燙傷后無水泡形成。燙傷3h皮膚淡紅色,燙傷界限不清。1d燙傷界限可清晰辨認(rèn)。5d痂皮形成。10d痂皮開始脫落。2

6、1d痂皮完全脫落。HE染色顯示,皮膚全層燙傷未累及背部肌肉,為深Ⅱ°燙傷。燙傷區(qū)域及其周邊多形核粒細(xì)胞浸潤1d達(dá)高峰。單個(gè)核細(xì)胞浸潤到燙傷區(qū)及周邊區(qū)3d達(dá)高峰。7d肉芽組織內(nèi)可見大量梭形成纖維細(xì)胞。14d表皮增厚明顯。17d損傷區(qū)細(xì)胞總數(shù)開始減少,肉芽組織向瘢痕組織轉(zhuǎn)變并且表皮完全覆蓋創(chuàng)口。Masson染色顯示,燙傷后5d-21d膠原纖維逐漸增多。正常小鼠皮膚的表皮、毛囊及皮脂腺均Nrf1染色陽性。皮膚燙傷后6h～1d,在皮膚損傷區(qū)及其

7、周邊區(qū)可見大量中性粒細(xì)胞Nrf1陽性;傷后1～7d,Nrf1陽性細(xì)胞主要以巨噬細(xì)胞為主;傷后10～2ld,Nrf1陽性染色主要在肌成纖維細(xì)胞中。Nrf1陽性細(xì)胞率于1d達(dá)高峰。中性粒細(xì)胞表達(dá)Nrf1的陽性率于1d達(dá)高峰;巨噬細(xì)胞表達(dá)Nrf1的陽性率于3d達(dá)高峰;肌成纖維細(xì)胞表達(dá)Nrf1的陽性率于14d達(dá)高峰。經(jīng)Westernblot檢測顯示,對照組及各個(gè)損傷時(shí)間段小鼠皮膚都有Nrf1陽性條帶,其中1d為Nrf1蛋白表達(dá)高峰。Real-t

8、imePCR結(jié)果顯示,對照組及各個(gè)損傷時(shí)間段小鼠皮膚都有Nrf1mRNA表達(dá),其中1d為表達(dá)高峰。
　　 結(jié)論：
　　 1、正常小鼠皮膚的表皮、毛囊及皮脂腺均Nrf1染色陽性。
　　 2、小鼠皮膚燙傷愈合過程中,中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞均Nrf1染色陽性。
　　 3、小鼠皮膚燙傷愈合過程中,Nrf1在不同細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以及Nrf1蛋白和基因的表達(dá)均具有一定的時(shí)間變化規(guī)律性,可作為推斷皮膚燙傷損傷時(shí)