基于鴨瘟病毒ICP4和UL48基因的熒光定量PCR方法的建立和應用.pdf

1、西11一日⑩呈。媳墨熹煮量專lk碩T學位論文基于鴨瘟病毒ICP4和UL48基因的熒光定量PCR方法的建立和應用張雨薇指導教師汪銘書教授校外導師王澤洲研宄員(省疾控中心)學位類別獸醫(yī)專業(yè)碩士領域名稱預防獸醫(yī)學研究方簡禽病學2016年12月摘要鴨瘟病毒(DuckPlagueVirus，DPV)又稱鴨皰疹病毒1型，屬于皰疹病毒科皰疹病毒屬。DPV感染所致的鴨瘟引起鴨、鵝急熱性、敗血性疾病，是一種高度致死性傳染病。DPV病毒能夠在鴨體內(nèi)建立潛伏

2、感染，嚴重威脅著鴨瘟疾病的防治工作，對鴨瘟及其潛伏感染進行快速、精確地檢測對于鴨瘟的預防極為重要。本實驗對DPV的ICP4基因類型進行鑒定，建立了檢測ICP4、UL48基因的熒光定量PCR(FQPCR)檢測方法，將該方法應用于24份鴨血液臨床樣本以及鴨瘟潛伏感染模型鴨三叉神經(jīng)中病毒相應基因表達情況的檢測，具體工作有：①運用藥物抑制實驗對ICP4進行基因類型鑒定；②構建基于ICP4和UL48基因的FQPCR與反轉(zhuǎn)錄FQPCR檢測方法；③運

3、用建立的FQPCR方法對鴨血液臨床樣本進行檢測，并與文獻中傳統(tǒng)PCR方法進行比較；④人工感染鴨瘟病毒CHv強毒株構建鴨瘟潛伏感染模型，運用建立的反轉(zhuǎn)錄FQPCR方法檢測了鴨三叉神經(jīng)中ICP4、UL48、TK和gC基因的mRNA水平。具體研究如下：1、DPV立即早期基因ICP4的鑒定利用抑制DNA復制的藥物更昔洛韋和抑制蛋白合成的藥物放線菌酮對DPVICP4的基因類型進行鑒定，并同時設置立即早期基因ICP27、早期基因dUTPase與晚期

4、基因US2作為對照。對照組立即早期基因ICP27、早期基因dUTPase與晚期基因US2的結(jié)果與文獻報道結(jié)果一致，說明試驗結(jié)果無誤；更昔洛韋與放線菌酮藥物組均可以擴增出ICP4基因特異性條帶，說明兩種藥物不能抑制ICP4基因的轉(zhuǎn)錄，即可證明ICP4基因為立即早期基因?！?、DPⅥCP4和UL48基因FQPCR方法的建立根據(jù)DPVCHv株ICP4基因的核苷酸序列，運用Oli9070軟件設計了ICP4全基因擴增引物進行PCR擴增，擴增片段大

5、小4881bp。使用pMDl9T載體進行連接，PCR以及測序結(jié)果顯示pMD19TICP4質(zhì)粒構建成功。運用NCBIConservedDomains工具分析ICP4、UL48基因序列，結(jié)果顯示ICP4、UL48基因保守度高。運用Oli9070軟件在其保守區(qū)域設計FQPCR引物，在NCBIPrimerBLAST檢測引物的特異性，結(jié)果顯示ICP4、UL48FQ—PCR引物都不僅能匹配DPVCHv株還能匹配其它DPV毒株。利用實驗室保存的pMD

6、l8T13actin、pET32aUL48質(zhì)粒和構建的pMDl9TICP4質(zhì)粒作標準品繪制標準曲線，得到的標準曲線相關系數(shù)分別為：flactin，R2=O996；ICP4，R2=0998；UL48，《=0997，標準曲線顯示Ct值與起始模板濃度呈高度相關性。分別根據(jù)公式：13actin，Y=一3427X41191；ICP4，Y=一3224X40218；UL48，Y亍3480X4479(Y=Ct值，X=拷貝數(shù)的對數(shù)值)可用于鴨13acti