基于鴨瘟病毒ICP4和UL48基因的熒光定量PCR方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、西11一日⑩呈。媳墨熹煮量專(zhuān)lk碩T學(xué)位論文基于鴨瘟病毒ICP4和UL48基因的熒光定量PCR方法的建立和應(yīng)用張雨薇指導(dǎo)教師汪銘書(shū)教授校外導(dǎo)師王澤洲研宄員(省疾控中心)學(xué)位類(lèi)別獸醫(yī)專(zhuān)業(yè)碩士領(lǐng)域名稱預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方簡(jiǎn)禽病學(xué)2016年12月摘要鴨瘟病毒(DuckPlagueVirus，DPV)又稱鴨皰疹病毒1型，屬于皰疹病毒科皰疹病毒屬。DPV感染所致的鴨瘟引起鴨、鵝急熱性、敗血性疾病，是一種高度致死性傳染病。DPV病毒能夠在鴨體內(nèi)建立潛伏

2、感染，嚴(yán)重威脅著鴨瘟疾病的防治工作，對(duì)鴨瘟及其潛伏感染進(jìn)行快速、精確地檢測(cè)對(duì)于鴨瘟的預(yù)防極為重要。本實(shí)驗(yàn)對(duì)DPV的ICP4基因類(lèi)型進(jìn)行鑒定，建立了檢測(cè)ICP4、UL48基因的熒光定量PCR(FQPCR)檢測(cè)方法，將該方法應(yīng)用于24份鴨血液臨床樣本以及鴨瘟潛伏感染模型鴨三叉神經(jīng)中病毒相應(yīng)基因表達(dá)情況的檢測(cè)，具體工作有：①運(yùn)用藥物抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)ICP4進(jìn)行基因類(lèi)型鑒定；②構(gòu)建基于ICP4和UL48基因的FQPCR與反轉(zhuǎn)錄FQPCR檢測(cè)方法；③運(yùn)

3、用建立的FQPCR方法對(duì)鴨血液臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，并與文獻(xiàn)中傳統(tǒng)PCR方法進(jìn)行比較；④人工感染鴨瘟病毒CHv強(qiáng)毒株構(gòu)建鴨瘟潛伏感染模型，運(yùn)用建立的反轉(zhuǎn)錄FQPCR方法檢測(cè)了鴨三叉神經(jīng)中ICP4、UL48、TK和gC基因的mRNA水平。具體研究如下：1、DPV立即早期基因ICP4的鑒定利用抑制DNA復(fù)制的藥物更昔洛韋和抑制蛋白合成的藥物放線菌酮對(duì)DPVICP4的基因類(lèi)型進(jìn)行鑒定，并同時(shí)設(shè)置立即早期基因ICP27、早期基因dUTPase與晚期

4、基因US2作為對(duì)照。對(duì)照組立即早期基因ICP27、早期基因dUTPase與晚期基因US2的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果無(wú)誤；更昔洛韋與放線菌酮藥物組均可以擴(kuò)增出ICP4基因特異性條帶，說(shuō)明兩種藥物不能抑制ICP4基因的轉(zhuǎn)錄，即可證明ICP4基因?yàn)榱⒓丛缙诨??！?、DPⅥCP4和UL48基因FQPCR方法的建立根據(jù)DPVCHv株ICP4基因的核苷酸序列，運(yùn)用Oli9070軟件設(shè)計(jì)了ICP4全基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大

5、小4881bp。使用pMDl9T載體進(jìn)行連接，PCR以及測(cè)序結(jié)果顯示pMD19TICP4質(zhì)粒構(gòu)建成功。運(yùn)用NCBIConservedDomains工具分析ICP4、UL48基因序列，結(jié)果顯示ICP4、UL48基因保守度高。運(yùn)用Oli9070軟件在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)FQPCR引物，在NCBIPrimerBLAST檢測(cè)引物的特異性，結(jié)果顯示ICP4、UL48FQ—PCR引物都不僅能匹配DPVCHv株還能匹配其它DPV毒株。利用實(shí)驗(yàn)室保存的pMD

6、l8T13actin、pET32aUL48質(zhì)粒和構(gòu)建的pMDl9TICP4質(zhì)粒作標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為：flactin，R2=O996；ICP4，R2=0998；UL48，《=0997，標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示Ct值與起始模板濃度呈高度相關(guān)性。分別根據(jù)公式：13actin，Y=一3427X41191；ICP4，Y=一3224X40218；UL48，Y亍3480X4479(Y=Ct值，X=拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值)可用于鴨13acti