小白菊內(nèi)脂對(duì)人雄激素非依賴(lài)性前列腺癌Du-145細(xì)胞的體外作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:近年來(lái)，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率和病死率也在呈上升趨勢(shì)。該病的早期可手術(shù)治療。因?yàn)槟[瘤的發(fā)展依賴(lài)于雄激素的存在，對(duì)于錯(cuò)失手術(shù)時(shí)機(jī)多數(shù)患者可行雄激素阻斷治療，但隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤往往轉(zhuǎn)變?yōu)榧に氐挚剐颓傲邢侔?hormone-refractoryprostatecancer,HRPC)。因此繼續(xù)開(kāi)發(fā)一種能有效地控制腫瘤生長(zhǎng)，改善患者癥狀的藥物具有重要的意義。小白菊內(nèi)酯(panhenolide，PTL)是從中草藥艾菊中提取的，屬于倍半

2、萜稀內(nèi)酯類(lèi)化合物，在一些西方國(guó)家，早年間已被提純并用于消炎鎮(zhèn)痛之用。一般被用于治療關(guān)節(jié)炎、頭痛、偏頭痛及感冒發(fā)熱等，隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)小白菊的深入研究，現(xiàn)已證實(shí)小白菊內(nèi)酯在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制效果，如乳腺癌、胃癌及肝癌等多種腫瘤。近幾年國(guó)外一些研究表明PTL可能對(duì)前列腺癌有一定作用，但研究較少，且浮于表面，具體作用大小及機(jī)制尚不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察PTL對(duì)體外培養(yǎng)的人雄激素非依賴(lài)性前列腺癌DU-145細(xì)胞的增殖、凋亡的影

3、響并探討其作用機(jī)制，旨在為前列腺癌的輔助治療及PTL的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 體外細(xì)胞傳代培養(yǎng)人前列腺癌DU-145細(xì)胞。待細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，大約生長(zhǎng)至70％時(shí)，進(jìn)行藥物刺激。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞給予不同濃度的PTL處理，對(duì)照組細(xì)胞給予生理鹽水處理。
　　 2.細(xì)胞增殖分析
　　 分別應(yīng)用MTT法和及細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)細(xì)胞增殖分析。以測(cè)定檢測(cè)各濃度、時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的吸光度OD值，

4、推算抑制率，評(píng)估PTL是否影響DU-145細(xì)胞增殖。
　　 3.流式細(xì)胞學(xué)分析
　　 取敏感濃度，以濃度梯度分組處理各組細(xì)胞后，消化制備成單細(xì)胞懸液，然后經(jīng)過(guò)經(jīng)固定、洗滌及染色等過(guò)程后，用流式細(xì)胞學(xué)分析PTL對(duì)DU-145細(xì)胞周期分布和凋亡的影響。
　　 4.免疫細(xì)胞化學(xué)染色
　　 將細(xì)胞接種于玻片上，用PTL處理48h后，取出玻片將各組細(xì)胞固定。用TritonX-100處理玻片，封閉后一抗及二抗結(jié)合反應(yīng)

5、，然后通過(guò)DAB顯色后光鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其所占比例，檢測(cè)KI67蛋白表達(dá)率。
　　 5.Western印跡分析
　　 取等量細(xì)胞總蛋白，加樣與SDS聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)過(guò)電泳、電轉(zhuǎn)膜，封閉、一抗及二抗結(jié)合、化學(xué)發(fā)光等過(guò)程，然后對(duì)Cleaved-caspase3、Bcl-2和Bax蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 1.PTL抑制DU-145細(xì)胞增殖
　　 MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析顯示，PTL可以明

6、顯抑制DU-145細(xì)胞增殖，具有明顯的時(shí)間和濃度依賴(lài)性，呈明顯的正相關(guān)性(P＜0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明，PTL處理DU-145細(xì)胞后增殖標(biāo)志物KI67蛋白表達(dá)降低，與濃度呈負(fù)相關(guān)性(P＜0.05)。
　　 2.PTL促進(jìn)DU-145細(xì)胞凋亡
　　 流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果表明，PTL促進(jìn)DU-145細(xì)胞阻滯于G0/G1期(P＜0.01)，并誘導(dǎo)DU-145細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡峰(P＜0.05)。Western印跡結(jié)果表明

7、PTL處理DU-145細(xì)胞后增殖凋亡標(biāo)志物Cleaved-caspase3表達(dá)增加，與濃度呈正相關(guān)性(P＜0.01)。Western印跡結(jié)果表明在PTL處理DU-145細(xì)胞后促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平明顯升高，與濃度呈正相關(guān)性(P＜0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，與濃度呈負(fù)相關(guān)性(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.小白菊內(nèi)酯可明顯抑制人前列腺癌DU-145細(xì)胞的增值，且呈明顯的時(shí)間、劑量依賴(lài)性

8、，可能與下調(diào)KI67蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　 2.小白菊內(nèi)酯對(duì)人前列腺癌DU-145細(xì)胞的細(xì)胞周期有一定影響。隨著藥物濃度的增小大，DU-145細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多，S和G2/M期細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。
　　 3.小白菊內(nèi)酯可以有效誘導(dǎo)人前列腺癌DU-145細(xì)胞凋亡，呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性。凋亡可能與上調(diào)人前列腺癌DU-145細(xì)胞中Cleaved-caspase3的表達(dá)有關(guān)。
　　 4.上調(diào)B