通用探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)禽病毒病方法的研究.pdf

1、禽病毒性疾病是威脅養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的一類傳染病，由于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是一種新型的核酸檢測(cè)技術(shù)，它從病毒的基因組著手對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)，在臨床診斷中已經(jīng)用于細(xì)菌、病毒及遺傳性疾病的檢測(cè)，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。本研究根據(jù)熒光PCR檢測(cè)原理，利用通用探針建立了禽病毒性疾病實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。這一個(gè)研究方法不但摒棄了SYBRGreenI類熒光染料假陽性率高的弊端，而且具有快速、準(zhǔn)確、高效的特性。本研究共分為三部分： 第一部分：新城疫病毒的分

2、離和鑒定為了研究我國(guó)近年來病毒性疾病的流行情況，擬對(duì)本實(shí)驗(yàn)所涉及病毒做出分離和鑒定，但是由于時(shí)間有限，故只做了新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)的分離和鑒定工作。本部分采用雞胚尿囊腔培養(yǎng)，血凝(Hemagglutination，HA)和血凝抑制(Hemagglutinationinhibition，HI)，間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA)，RT-PCR/PCR試驗(yàn)和基因芯片試驗(yàn)對(duì)NDV進(jìn)行了分離和鑒定。從全國(guó)七個(gè)

3、省市的9個(gè)雞場(chǎng)53只疑似患有新城疫病的雞中，分離到28株NDV野毒株，結(jié)果說明NDV在我國(guó)普遍存在，而且呈現(xiàn)蔓延的趨勢(shì)；同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果說明基因芯片方法要優(yōu)于其他三種檢測(cè)方法，具有高度的特異性和靈敏度。 第二部分：通用探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)禽病毒病方法的建立本部分首先構(gòu)建含有NDV特定片段的質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行了通用探針實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，然后以優(yōu)化好的通用探針實(shí)時(shí)熒光PCR條件對(duì)傳染性喉氣管炎病毒(Infecti

4、ousLaryngotracheitisViruse，ILT)、傳染性支氣管病毒((InfectiousBronchitisViruse，IBV)、傳染性法氏囊病病毒(InfectiousbursalDiseaseVriuse，IBDV)進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)，并對(duì)本試驗(yàn)方法進(jìn)行了評(píng)估。 根據(jù)GenbankNDVmRNA全序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物(UP1：5’-GCCAACATCCTCCGATTA-3’；DOWN：5'-AGTGATTTG

5、TGGTCCGAATCA-3’)。提取NDV種毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用上述一對(duì)引物進(jìn)行PCR，純化產(chǎn)物與pMD18-TSimpleVector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后，進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明該NDV特定片段克隆成功。 根據(jù)通用探針實(shí)時(shí)熒光PCR的探針和引物的設(shè)計(jì)要求設(shè)計(jì)出通用探針實(shí)時(shí)熒光PCR所使用的引物和探針，以構(gòu)建好的NDV的質(zhì)粒為模板，從熒光強(qiáng)度、引物濃度、Mg2

6、+的濃度、探針的濃度、Taq酶和Buffer的用量等方面對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果主要是將熒光強(qiáng)度的檢測(cè)放在了變性階段，增加了PCRBuffer的用量，減少了Mg2+的濃度。 以優(yōu)化好的通用探針實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件，分別對(duì)ILTV、IBDV、IBV進(jìn)行了特異性檢測(cè)試驗(yàn)，同時(shí)也進(jìn)行了通用探針實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度、重復(fù)性、陽性樣品的檢測(cè)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果說明通用探針實(shí)時(shí)熒光PCR的具有高度的特異性和靈敏度，其檢驗(yàn)方法可對(duì)10-

7、10雞胚半數(shù)致死量的病毒進(jìn)行有效的檢測(cè)，靈敏度為普通PCR的1000～10000倍。 第三部分：通用探針實(shí)時(shí)熒PCR的初步應(yīng)用利用優(yōu)化好的反應(yīng)條件對(duì)來自山東各地不同雞場(chǎng)疑似患有新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)、傳染性喉氣管炎病毒(InfectiousLaryngotracheitisViruse，ILT)、傳染性支氣管病毒((InfectiousBronchitisViruse，IBV)、傳染性法