人鼻咽癌中癌干細(xì)胞的形態(tài)和組化特性及其臨床意義.pdf

1、背景與目的:
　　 鼻咽癌(NPC)是一種具有鮮明的地域和種族性分布的頭頸部腫瘤，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性:大多數(shù)為未分化型非角化性癌，早期轉(zhuǎn)移至頸部淋巴結(jié)。更重要的是，患者放化療后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這往往是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。80年代初期，姚開泰就首次提出鼻咽癌發(fā)病的“三次打擊”假說，即EB病毒(EBV)、化學(xué)致癌物和胚性擊中（即遺傳因素或自發(fā)/誘發(fā)突變）構(gòu)成NPC的主要病因。近年來，學(xué)者們對鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制亦作

2、了大量的研究。然而，鼻咽癌惡性侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制十分復(fù)雜。如何能早期對鼻咽癌患者的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能進(jìn)行準(zhǔn)確評估，從而指導(dǎo)臨床進(jìn)行及時、有效的治療，提高鼻咽癌患者的生存率、改善其預(yù)后，這是廣大醫(yī)療和科研工作者當(dāng)務(wù)之急。
　　 癌干細(xì)胞(CSCs)目前是腫瘤研究中的熱點(diǎn)之一。CSCs理論認(rèn)為腫瘤組織內(nèi)有一小群細(xì)胞具有與干細(xì)胞類似的特性，即具有自我更新和多向分化的生物學(xué)特性，是惡性腫瘤患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及放化療耐受的根源所在

3、。近年來，學(xué)者們已通過表面分子標(biāo)志物篩選成功分離和鑒定乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等多種實(shí)體惡性腫瘤。2007年，姚開泰等最先提出和證實(shí)了鼻咽癌組織中存在CSCs細(xì)胞。最近，我們首次證實(shí)ALDH1（乙醛脫氫酶1）可作為分離和鑒定鼻咽癌CSCs的一種可靠的分子標(biāo)記物。有興趣的是，愈來愈多的研究表明，CSCs“干性”與EMT(上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化)的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。廣為人知，EMT在惡性腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，其促使腫瘤細(xì)胞更容易

4、從原發(fā)灶脫離，從而往周邊間質(zhì)進(jìn)行侵襲和擴(kuò)散。在鼻咽癌組織病檢切片中，我們觀察到，侵襲邊緣或者浸潤周邊組織中的腫瘤細(xì)胞常常呈梭形間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，這些梭形細(xì)胞中ALDH1的表達(dá)水平明顯上調(diào)，提示其具有CSCs“干性”特性。早在1960年，我國著名的病理學(xué)家梁伯強(qiáng)就發(fā)現(xiàn)，這些具有高度侵襲能力的梭形細(xì)胞容易侵犯患者的顱底神經(jīng)。然而，有關(guān)這種梭形癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為以及相關(guān)分子特征，至今為止，人們知之甚少。
　　 因此

5、，本課題的主要研究目的是:①檢測這些梭形癌細(xì)胞與EMT發(fā)生之間的關(guān)系;②檢測EMT相關(guān)蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與鼻咽癌的侵襲性生物學(xué)行為的關(guān)系，評估其對患者預(yù)后的影響;③進(jìn)一步，我們擬通過表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)篩選出鼻咽癌組織中EMT相關(guān)基因，為深入了解鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移惡性進(jìn)程中的具體分子機(jī)制及其生物學(xué)功能奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 第一部分:鼻咽癌組織中梭形癌細(xì)胞具有EMT和CSCs特性:

6、　　 1.通過免疫組化方法在115例鼻咽癌組織梭形癌細(xì)胞和47例鱗狀癌細(xì)胞中檢測Pan-cytokeratin(全角蛋白)、E-cadherin(E-鈣粘素)、N-cadherin(巢蛋白)、β-catenin、vimentin(波形蛋白)、fibronectin(纖維粘連蛋白)、Snail、Slug、ALDH1、SOX2、OCT4和Nanog等蛋白的表達(dá)情況;在此基礎(chǔ)上，我們擬進(jìn)一步檢測梭形癌細(xì)胞的比例與鼻咽癌惡性生物學(xué)行為及預(yù)后的

7、關(guān)系。
　　 2.通過免疫組化和組織熒光方法檢測腫瘤出芽和ALDH1在105例鼻咽癌組織中的表達(dá)情況。
　　 第二部分EMT和CSCs相關(guān)蛋白在鼻咽癌組織的表達(dá)及臨床意義:
　　 1.構(gòu)建包含122例鼻咽癌組織和29例慢性鼻咽炎組織在內(nèi)的組織芯片（TMA）;
　　 2.通過免疫組化方法檢測EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、vimentin和Snail，CSCs相

8、關(guān)蛋白ALDH1、SOX2、OCT4、Nanog和Nestin等蛋白在122例鼻咽癌的表達(dá)情況，分析它們的表達(dá)與臨床病理特征和患者預(yù)后之間的聯(lián)系;組織免疫熒光確證某些EMT或CSCs相關(guān)蛋白的定位表達(dá)。
　　 3.上述EMT和CSCs相關(guān)標(biāo)志物蛋白在122例鼻咽癌組織中進(jìn)行聚類分析。
　　 第三部分:基因表達(dá)譜高通量篩選鼻咽癌組織中EMT相關(guān)基因:
　　 1.篩選出25例鼻咽癌活檢組織及8例鼻咽正常上皮組織作為芯

9、片實(shí)驗(yàn)對象，采用北京博奧22KHumanGenomeArray人表達(dá)譜基因芯片進(jìn)行芯片檢測;
　　 2.SAM軟件分析差異表達(dá)基因，qRT-PCR進(jìn)行鑒定。在此基礎(chǔ)上，通過在線網(wǎng)站進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘，篩選出鼻咽癌中與EMT相關(guān)基因，并對其進(jìn)行GO功能分析、KEGG通路和層次聚類等分析。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分鼻咽癌組織中梭形癌細(xì)胞具有EMT和CSCs特性:
　　 1.與鱗狀癌細(xì)胞比較，Pan-cytoke

10、ratin在梭形癌細(xì)胞中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.644)。相反，膜E-cadherin在梭形癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)，而β-catenin、N-cadherin、vimentin、fibronectin、Snail、Slug、ALDH1、SOX2、OCT4和Nanog蛋白在梭形癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào)，兩組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。此外，在梭形癌細(xì)胞中，膜E-cadherin表達(dá)與漿β-catenin(P＜0.00

11、1)、vimentin(P＜0.001),fibronectin(P＜0.001)、Slug(P＜0.001)、ALDH1(P＜0.001)OCT4(P＜0.001)和Nanog(P＜0.001）表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，但與N-cadherin(P=0.086)、Snail(P=0.093)和SOX2(P=0.0875)之間的表達(dá)無明顯相關(guān)。
　　 有興趣的是，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，梭形癌細(xì)胞含量與鼻咽癌T分期(P=0.036)、N分期（P

12、=0.031）、臨床分期(P=0.037)、淋巴管浸潤(P=0.025)以及生存預(yù)后(P=0.004)有密切關(guān)系。
　　 2.在105例鼻咽癌組織中，腫瘤細(xì)胞低出芽組和高出芽組分別為53例(50.5％)和52例(49.5％)。腫瘤出芽(tumorbudding)與腫瘤T分期(P=0.008)、淋巴管浸潤(P＜0.001)、血管浸潤(P=0.029)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.001)以及臨床分期(P=0.010)有著密切關(guān)聯(lián)。單因

13、素分析表明，腫瘤出芽高組中患者總體生存率明顯低于低出芽組(P=0.002)。Cox多因素回歸分析表明，腫瘤出芽是影響患者生存預(yù)后的一個獨(dú)立因素(P=0.001）。并且，腫瘤出芽ALDH1表達(dá)與腫瘤T分期(P=0.034)、淋巴管浸潤(P=0.002)、血管浸潤(P=0.017)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.035)、臨床分期(P＜0.001)以及總體生存期(P＜0.001)有著密切關(guān)聯(lián)。
　　 第二部分:EMT和CSCs相關(guān)蛋白在鼻

14、咽癌組織中的表達(dá)及其臨床意義:
　　 1.E-cadherin胞膜和胞漿表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(分別P＜0.001和0.005)以及臨床分期(分別P＜0.001和0.007)有關(guān)聯(lián)。β-catenin胞漿表達(dá)與T分期(P=0.020)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.001)和臨床分期(P=0.036)有關(guān)，而β-catenin胞膜表達(dá)與患者的臨床病理參數(shù)均無關(guān)聯(lián)（P≥0.05）。Vimentin胞核表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.001)以及臨床分

15、期進(jìn)展(P＜0.001)密切相關(guān)。多因素生存分析表明，vimemtin核表達(dá)(P=0.016)以及E-cadherin胞漿表達(dá)(P=0.001)是影響患者生存預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。胞核vimentin/胞漿E-cadherin共表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.001)以及臨床分期進(jìn)展(P＜0.001)密切有關(guān)。更重要的是，胞核vimentin/胞漿E-cadherin共表達(dá)組中患者生存時間明顯縮短(P＜0.001)。
　　 2.在122例鼻

16、咽癌組織中，42.6％為N-cadherin胞漿高表達(dá)，45.1％為胞核高表達(dá)。N-cadherin胞漿和胞核表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期(P=0.012)均顯著有關(guān)。N-cadheri胞漿和胞核之間表達(dá)水平呈正相關(guān)(P＜0.001)。然而，N-cadherin胞漿或胞核表達(dá)與E-cadherin之間表達(dá)無相關(guān)性(P≥0.05）。單因素分析顯示，N-cadherin胞漿表達(dá)高低對患者生存時間差異影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

17、（P≥0.05）。然而，N-cadherin核高表達(dá)組中患者總體生存率明顯低于核表達(dá)低組(P=0.002)。此外，在鼻咽癌臨床晚期(Ⅲ-Ⅳ)患者中，N-cadherin核高表達(dá)組中的總體生存時間明顯低于表達(dá)低組(P=0.033)，但對Ⅰ-Ⅱ期患者總體生存期影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cox模型分析表明，N-cadherin胞核表達(dá)可作為一個獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)(P=0.024)。
　　 3.122例鼻咽癌組織中，46例(37.7％)為Snail

18、胞漿表達(dá)，60例(49.2％)為Snail胞核表達(dá)。除了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.042)，Snail胞漿表達(dá)與其它臨床病理參數(shù)之間不存在明顯關(guān)聯(lián)。相反，Snail胞核表達(dá)與T分期(P=0.045)，N分期(P=0.019)，M分期(P=0.046)及臨床分期進(jìn)展(P=0.003)均有顯著關(guān)聯(lián)。此外Snail胞核表達(dá)與E-cadherin胞膜表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.021)。單因素生存分析表明，鼻咽癌患者Snail胞核表達(dá)高組，而不是胞漿高表達(dá)

19、組，其總體生存期明顯低于低表達(dá)組(P＜0.001)。多因素生存分析表明，Snail核表達(dá)可以獨(dú)立影響鼻咽癌患者的生存預(yù)后(P＜0.001)，尤其是處于臨床Ⅲ-Ⅳ期患者。
　　 4.我們的結(jié)果顯示，SOX2，OCT4和Nanog蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)增高，并且在腫瘤組織侵襲邊緣尤為常見，與EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin/N-cadherin和Snail)顯著相關(guān)。Nestin在鼻咽癌組織中甚少表達(dá)，然而，其在腫瘤組織侵襲邊緣

20、的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)明顯增高。侵襲邊緣SOX2，OCT4或Nanog表達(dá)高組，患者總體生存率明顯低于各低表達(dá)組(分別P=0.006，0.001和0.000)。多因素生存分析表明，OCT4和Nanog表達(dá)是影響患者預(yù)后的有價值的獨(dú)立指標(biāo)(分別P=0.006和0.001)。并且，腫瘤侵襲邊緣OCT4/Nanog共表達(dá)組，患者總體生存率明顯低于其它組別(P=0.005)。此外，有興趣的是，在鼻咽癌組織的侵襲邊緣，SOX2，OCT4和Nanog

21、與CSCs標(biāo)記物ALDH1以及血管內(nèi)皮表達(dá)的Nestin蛋白呈顯著正相關(guān)(P＜0.001)。
　　 5.鼻咽癌組織中侵襲邊緣ALDH1的表達(dá)與患者T分期(P=0.001)，M分期(P＜0.001)，臨床分期(P＜0.001)以及淋巴管浸潤(P＜0.001)有關(guān)，組間差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在鼻咽癌組織的侵襲邊緣，ALDH1的表達(dá)水平與EMT相關(guān)蛋白如E-cadherin胞漿表達(dá)(P=0.001)，vimentin胞核表達(dá)(P＜0.

22、001)以及Snail(P＜0.001)存在顯著正相關(guān)。單因素分析顯示，患者腫瘤侵襲邊緣ALDH1高表達(dá)組，其總體生存率明顯降低。然而，多因素生存分析表明，侵襲邊緣ALDH1表達(dá)不是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素。侵襲邊緣ALDH1表達(dá)對早期鼻咽癌患者(T1-T2，N0-N1)的總體生存率有著重要影響(分別P＜0.001，P=0.002)。
　　 6.上述EMT和CSCs相關(guān)蛋白將122例鼻咽癌組織聚類成兩大組(GroupA和Group

23、B)。與GroupA相比，GroupB中膜E-cadherin表達(dá)明顯減少，而漿E-cadherin、vimentin、N-cadherin、Snail、OCT4和Nanog等表達(dá)明顯上調(diào)。而且，我們結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GroupB與患者T分期、N分期、M分期、臨床分期的進(jìn)展以及梭形癌細(xì)胞的比例(≥20％)有著密切聯(lián)系。更重要的是，GroupB鼻咽癌患者的總體生存率明顯低于GroupA組。
　　 第三部分:基因表達(dá)譜篩選鼻咽癌組織中EMT

24、相關(guān)基因:
　　 1.與鼻咽正常上皮組織比較，鼻咽癌組織中共有509個差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)基因306個，表達(dá)下調(diào)基因203個，這些差異基因主要參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞粘附，蛋白酶水解，細(xì)胞周期，細(xì)胞生長和凋亡等。
　　 2.通過專業(yè)文獻(xiàn)挖掘軟件，我們篩選與EMT密切相關(guān)的50個差異表達(dá)基因，GO功能分析表明，這些基因主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，細(xì)胞粘附，細(xì)胞信號傳導(dǎo)，蛋白酶水解，趨化作用及器官形成等有關(guān)。KEGG通路分析軟件表明

25、，這些鼻咽癌EMT相關(guān)基因主要涉及到Wnt信號通路，p53信號通路和MAPK信號通路等。并且，這些差異表達(dá)基因與鼻咽癌的臨床病理特征如T分期、N分期、M分期和臨床分期密切關(guān)聯(lián)。
　　 結(jié)論:
　　 1.鼻咽癌組織中的梭形癌細(xì)胞具有EMT和CSCs特性，其含量與鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)程密切相關(guān);鼻咽癌組織中侵襲邊緣存在腫瘤出芽現(xiàn)象，細(xì)胞具有CSCs特性;我們提出，前者是轉(zhuǎn)移，而后者是早期侵襲的形態(tài)學(xué)風(fēng)險標(biāo)志。
　　 2