LPS誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的機(jī)制及EPA的防護(hù)作用研究.pdf

1、帕金森病是一種常見(jiàn)于老年人的慢性退行性疾病，其最具特征性的神經(jīng)病理學(xué)變化是DA能神經(jīng)元的進(jìn)行性缺失和特征性的Lewy’s小體的形成。近年來(lái)對(duì)PD的實(shí)驗(yàn)研究取得了突破性的進(jìn)展，但其確切機(jī)制仍然不明確。自1988年McGee等在PD患者的中腦黑質(zhì)致密帶(SNpc)中發(fā)現(xiàn)了激活的小膠質(zhì)細(xì)胞后，以小膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征的神經(jīng)免疫炎癥機(jī)制開(kāi)始受到關(guān)注。
　　小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervessys

2、tem,CNS)內(nèi)的主要免疫效應(yīng)器，在腦內(nèi)各部都有分布，尤以黑質(zhì)分布最多。在炎癥、缺血及中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中發(fā)揮作用。脂多糖是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要組成成分，是一種強(qiáng)烈的致炎因子。目前，關(guān)于LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)開(kāi)展的很多，但其確切的機(jī)制卻仍然不清。
　　二十碳五烯酸(EicosapentaenoicAcid,EPA)，是n-3系多不飽和脂肪酸(n-3PUFAs)的一種，其天然來(lái)源是海洋動(dòng)物。EPA有五個(gè)不飽

3、和鍵和4個(gè)活潑的亞甲基，這使得EPA極易受光、熱、金屬元素及自由基的影響。許多研究發(fā)現(xiàn)，EPA具有抗炎、預(yù)防心血管疾病、降脂和抑制腫瘤生長(zhǎng)等方面的作用，其中抗炎作用受到廣泛關(guān)注，但其確切機(jī)制仍然不明確。
　　目的：
　　通過(guò)LPS直接作用于PC12細(xì)胞，觀察LPS對(duì)PC12細(xì)胞的影響；建立PC12細(xì)胞與BV-2細(xì)胞共培養(yǎng)體系，觀察LPS對(duì)PC12細(xì)胞的影響和對(duì)BV-2細(xì)胞的活化；觀察EPA對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞活化的影響

4、及其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1．通過(guò)體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞，以不同濃度LPS(0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)作用24h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、比色法測(cè)定培養(yǎng)基中LDH的含量、Western-blot檢測(cè)細(xì)胞中TH的表達(dá)；
　　2．建立BV2細(xì)胞和PC12細(xì)胞共培養(yǎng)模型，以不同濃度LPS(0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)作用24h，流式

5、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡、比色法測(cè)定培養(yǎng)基中LDH的含量、E-lisa檢測(cè)培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β的含量、Western-blot檢測(cè)細(xì)胞中TH的表達(dá)；
　　3．體外培養(yǎng)BV2細(xì)胞，以不同濃度LPS(0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)作用24h，觀察BV-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化、免疫熒光染色觀察細(xì)胞OX-42蛋白的表達(dá)、Western-blot檢測(cè)NF-κBp65和I-κB蛋白的表達(dá)、E-

6、lisa檢測(cè)培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β的含量；
　　4．體外培養(yǎng)BV-2細(xì)胞，以不同濃度EPA(25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)作用1h，LPS(1μg/mL)處理24h后，Western-blot檢測(cè)NF-κBp65和I-κB蛋白的表達(dá)、E-lisa檢測(cè)培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β的含量；
　　結(jié)果：
　　1．LPS作用于PC12細(xì)胞時(shí)，對(duì)其凋亡、TH表達(dá)和LDH的釋放都沒(méi)有顯著性影響；

7、
　　2．LPS損傷了共培養(yǎng)體系中的PC12細(xì)胞，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)液中LDH釋放量顯著增加(P<0.05)、凋亡率顯著增高(P<0.05)、TH表達(dá)顯著降低(P<0.05)；
　　3．LPS作用于BV-2細(xì)胞24h，同對(duì)照相比，免疫熒光染色OX-42顯示熒光顆粒顯著增多。細(xì)胞內(nèi)NF-κBp65隨著LPS濃度的增加表達(dá)增加，而I-κB則隨著LPS濃度的增加表達(dá)降低，同對(duì)照組相比，0.5μg/mLLPS組和1μg/mLLPS組

8、差異具有顯著性(P<0.05)。培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β的濃度均隨著LPS濃度的增加而濃度增高，同對(duì)照組相比，0.5μg/mLLPS組和1μg/mLLPS組差異具有顯著性(P<0.05)；
　　4．EPA抑制BV-2細(xì)胞的活化：與LPS組相比，100μmol/LEPA組NF-κBp65的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而I-κB的表達(dá)則顯著增高(P<0.05)；50μmol/LEPA組和100μmol/LEPA組培養(yǎng)基中TNF