香煙提取物對血栓調(diào)節(jié)蛋白的影響暨伐尼克蘭對氯吡格雷抗血小板作用影響的研究.pdf

1、吸煙是心血管疾病的獨立危險因素，可導致內(nèi)皮功能紊亂，炎癥反應(yīng)增加，血管內(nèi)血栓形成，易誘發(fā)急性心血管事件的發(fā)生。其中針對吸煙導致血栓形成機制的研究雖有報道，但是目前尚未闡明。血栓調(diào)節(jié)蛋白（Thrombomodulin,TM）是內(nèi)皮細胞表面的一種糖蛋白，作為一個重要的抗凝輔助因子，它與凝血酶以1：1結(jié)合，通過激活蛋白C起到抗凝作用。而TM與凝血酶的結(jié)合不僅取決于TM量的表達，而且也取決于其與凝血酶在單分子水平的親和力。目前針對吸煙對TM表達

2、量的研究雖有少量報道，但是研究結(jié)果顯示吸煙對可溶性TM表達的影響不一致；另外，對于TM與凝血酶在單分子水平的相互作用的研究未見報道。吸煙是否通過影響TM量的表達或者影響其與凝血酶的結(jié)合力這條途徑導致血管內(nèi)血栓形成不清楚。
　　研究表明，支架術(shù)后患者持續(xù)吸煙會增加支架內(nèi)再狹窄率及心血管事件的發(fā)生，然而戒煙可以使冠心病患者的死亡率下降36％。由于吸煙是一種成癮性疾病，戒除后病人會出現(xiàn)焦慮、煩躁等戒斷癥狀，同時機體里的尼古丁水平下降、從

3、而導致多巴胺水平下降，可能誘發(fā)心血管事件發(fā)生，而其僅憑個人毅力戒煙成功率很低，故需借助戒煙藥物緩解戒斷癥狀，提高戒斷率，從而減少心血管事件的發(fā)生。伐尼克蘭是一種尼古丁乙酰膽堿受體部分激動劑，目前已被全球70多個國家批準為戒煙輔助藥。支架術(shù)后病人常規(guī)服用氯吡格雷抗血小板治療，防止支架內(nèi)血栓形成。故有可能支架術(shù)后的病人同時服用戒煙藥物和氯吡格雷。但是兩者間是否有藥物相互作用，目前沒有循證醫(yī)學證據(jù)。
　　第一部分香煙提取物對血管內(nèi)皮細胞

4、表面血栓調(diào)節(jié)蛋白表達的影響
　　目的：研究不同條件下的香煙提取物（CigaretteSmokeExtract,CSE）對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialCell,HUVEC）表面TM量的表達，從而探討吸煙導致血管內(nèi)血栓形成的可能機制。
　　方法：參照Nakamura方法制備CSE在30min內(nèi)用于實驗。以0.1%I型膠原酶37℃消化15-20min人臍靜脈內(nèi)皮，分離獲得的原代HUV

5、EC用低血清內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)至融合后傳代；用VIII因子相關(guān)抗原鑒定HUVEC，將第2-3代細胞用于實驗。將第3代HUVEC接種至6孔板，用不同濃度CSE（0、0.5%、1%、2.5%、5%）同一時間（6小時）及同一濃度5%CSE不同時間（0h、6h、10h、12h、24h）孵育、收集細胞，分別采用流式細胞儀計數(shù)和實時熒光定量PCR（Real-timePCR）方法檢測TM的蛋白量和mRNA水平的表達。

6、
　　結(jié)果：（1）與對照組相比，6小時不同濃度（0.5%、1%、2.5%、5%）CSE降低了HUVEC表面TM在mRNA和蛋白水平的表達（P＜0.01）；mRNA水平組間比較除了0.5%CSE和1%CSE組沒有統(tǒng)計學差異，其它兩兩濃度比較均有顯著差異（P＜0.001）；蛋白水平組間比較，5%CSE組與0.5%CSE組有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）,其它濃度組間比較無統(tǒng)計學差異。
　?。?）與對照組比較，同一濃度(5%)CSE不

7、同時間（6h、10h、12h、24h、）明顯降低了HUVEC表面TM在mRNA和蛋白水平的表達（P＜0.01)；并且在12小時以內(nèi)TM的表達隨著時間延長逐漸降低，至24小時以后TM表達不再繼續(xù)下降。
　　結(jié)論：CSE可下調(diào)HUVEC表面TM的表達，并呈量-效關(guān)系。12小時以內(nèi)呈時-效關(guān)系。
　　第二部分香煙提取物對血栓調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶結(jié)合力的影響
　　目的：利用單分子力譜法檢測CSE處理后的TM與凝血酶單分子水平結(jié)合力

8、，從而探討吸煙導致血管內(nèi)血栓形成的可能機制。
　　方法：1.從HUVEC中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，構(gòu)建TM-GFP質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至COS-7細胞分組測力：（1）空白質(zhì)粒對照組（GFP-thrgroup）（2）TM-GFP對照組（TM-thrgroup）（3）5%CSE孵育空白質(zhì)粒細胞組（CSE-GFP-thrgroup）（4）5%CSE孵育TM-GFP細胞1小時組（CSE-TM-thr1hgroup）（5）5%CSE孵育TM-

9、GFP細胞6小時組（CSE-TM-thr6hgroup）每組測力后均加入鼠抗人特異單克隆抗TM抗體行封閉阻斷實驗。
　　在2.0±0.5×103pN/s的加載速率范圍下，對熒光顯微鏡下觀察各組細胞所獲得的TM熒光融合蛋白聚集區(qū)，用凝血酶修飾的原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope,AFM)探針反復在細胞表面下壓-回拉，隨機獲得力-距離曲線，統(tǒng)計得出針尖和細胞間親和力的高斯分布及成鍵幾率。
　　2.用流式細胞

10、儀計數(shù)法檢測5%CSE孵育TM-GFP轉(zhuǎn)染后的COS-7細胞1h、6h的熒光強度。
　　結(jié)果：（1）TM-Thr對照組高斯擬合的結(jié)合力：TM與凝血酶最可幾的相互作用力的大小為60.90311±0.81723pN，TM與凝血酶的AFM成鍵幾率為22.58±3.95%，抗體阻斷后成鍵幾率為2.58±2.0%。
　?。?）與TM-Thrgroup比較，GFP-Thrgroup，CSE-TM-Thr1hgroup，CSE-TM-Th

11、r6hgroup，CSE-GFP-Thrgroup四組AFM成鍵幾率明顯減低，P<0.0001；但四組間兩兩比較無統(tǒng)計學差異。
　?。?）用流式細胞儀計數(shù)法檢測5%CSE孵育TM-GFP轉(zhuǎn)染后的COS-7細胞1h、6h的熒光強度表達結(jié)果：和對照組比較，5%CSE組1h、6h熒光強度沒有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：在CSE孵育COS-7細胞1小時、6小時不影響TM熒光量的表達下，CSE可明顯減少TM與凝血酶的成鍵幾率。結(jié)合第一部分

12、研究提示：吸煙可能通過下調(diào)TM量的表達并減少其與凝血酶結(jié)合幾率，抑制了TM的抗凝作用，從而導致血管內(nèi)血栓形成。
　　第三部分伐尼克蘭對氯吡格雷抗血小板作用影響的研究
　　目的：通過觀察戒煙藥物伐尼克蘭對氯吡格雷抗血小板作用的影響，企圖為戒煙藥物和抗血小板聯(lián)合用藥的安全性方面提供循證醫(yī)學證據(jù)。
　　方法：連續(xù)選取自2010年7月至2012年3月在武警總醫(yī)院心內(nèi)科住院的擇期行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（Percutaneousc

13、oronaryintervention,PCI）術(shù)的冠心病吸煙患者136例，簽署知情同意書后隨機分為兩組：常規(guī)治療組和常規(guī)治療加伐尼克蘭組。所有入選病人均于術(shù)前給予阿司匹林100mg/d,氯吡格雷300mg/d，隨后給予75mg/d服用第三天隨機給與或不給與伐尼克蘭治療，兩組均提供戒煙方法和咨詢隨訪。記錄所有病人的冠心病危險因素、合并疾病及合并用藥等情況。服用氯吡格雷前、伐尼克蘭前抽血化驗血生化（血糖、血脂、肝腎功、尿酸、心肌標志物等）

14、、血小板聚集率、血小板反應(yīng)指數(shù)(plateletreactivityindex,PRI)及服用后第7天、14天抽血化驗血肌酐、心肌標志物、血小板聚集率、PRI，記錄不良事件和嚴重不良事件。
　　結(jié)果：1.兩組基線水平比較無差別。
　　2.常規(guī)治療組和伐尼克蘭組在服用伐尼克蘭2周的血小板聚集率及PRI比較
　?。?）PRI%:服用氯吡格雷前80.08±5.60vs79.94±5.18，P=0.893；服用伐尼克蘭前55.

15、21±14.87vs53.74±14.47，P=0.591；服用伐尼克蘭1周41.87±17.05vs40.16±15.81，P=0.579；服用伐尼克蘭2周43.01±13.59vs42.18±11.27，P=0.723。兩組PRI均隨著時間的延長明顯降低，具有統(tǒng)計學差異（P=0.000）。
　?。?）血小板聚集率：
　　入院時：服用氯吡格雷前44.13±7.89vs43.67±7.31，P=0.744；服用伐尼克蘭前26

16、.53±11.27vs24.92±10.75，P=0.433；服用伐尼克蘭1周21.42±10.56vs20.45±9.75，P=0.612；服用伐尼克蘭2周23.61±10.09vs23.34±10.64，P=0.893。兩組血小板聚集率均隨著時間的延長明顯降低，具有統(tǒng)計學差異（P=0.000）。
　　3.（1）2周兩組腎功能比較
　　常規(guī)治療組和伐尼克蘭組的腎小球濾過率（estimatedglomerularfiltra

17、tionrate，eGFR）在各時間點均無統(tǒng)計學差異。
　?。?）不良事件和嚴重不良事件情況
　　伐尼克蘭組的不良事件較常規(guī)治療組略有增加，但兩組無統(tǒng)計學差異；嚴重不良事件：兩組均發(fā)生圍手術(shù)期心梗5例，并未發(fā)生支架內(nèi)血栓等其它嚴重不良事件。
　　結(jié)論：短期觀察伐尼克蘭與氯吡格雷合用不影響后者的抗血小板作用，是安全的。
　　總結(jié)：基礎(chǔ)研究提示：通過下調(diào)TM量的表達及影響其與凝血酶結(jié)合力，可能是吸煙導致血管內(nèi)血栓形成