Bcl-XLsiRNA對人胃腺癌MGC-803細(xì)胞藥物敏感性的影響.pdf

1、目的研究靶向Bcl-XL基因的小干擾RNA對胃腺癌MGC-803細(xì)胞Bcl-XL基因表達(dá)的作用及對藥物敏感性的影響。 方法構(gòu)建GFP和Bcl-XLsiRNA載體，瓊脂糖凝膠電泳和測序證實序列的正確性。共轉(zhuǎn)染GFP表達(dá)載體與GFPsiRNA表達(dá)載體或GFP與陰性siRNA到胃腺癌MGC-803細(xì)胞，48小時后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞GFP的表達(dá)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Bcl-XLsiRNA或陰性siRNA到胃癌MGC-803細(xì)胞，G418抗生素篩選陽

2、性克隆，克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，RT-PCR方法檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)，免疫熒光觀察細(xì)胞蛋白表達(dá)。AO印跡觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化，流式細(xì)胞術(shù)觀察亞G1細(xì)胞的比例。用不同濃度的5-FU或DADS處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，MTT觀察細(xì)胞增殖的變化。用一種濃度的5-FU或DADS處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)觀察亞G1細(xì)胞的比例。 結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定提取質(zhì)粒的大小，測序證實siRNA插入模板進(jìn)行了正確連接。熒光顯微鏡結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)染GFP表達(dá)載體和G

3、FPsiRNA表達(dá)載體的細(xì)胞比共轉(zhuǎn)染GFP和陰性siRNA細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯減弱，GFP單獨(dú)轉(zhuǎn)染和GFP與陰性siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光強(qiáng)度沒有明顯的差別。RT-PCR和免疫熒光結(jié)果表明，Bcl-XLsiRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-XLmRNA和蛋白的表達(dá)比陰性siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Bcl-XL基因的表達(dá)均有明顯的降低。AO印跡細(xì)胞核鏡下表明，Bcl-XLsiRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞胞核有明顯可見的濃縮，邊緣化，有些裂解為碎塊；陰性siR

4、NA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞未觀察到這種改變。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，Bcl-XLsiRNA細(xì)胞組與陰性siRNA細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的亞G1細(xì)胞百分比例分別為：21.17±1.26％vs1.19±0.18％or1.56±0.15％，說明Bcl-XLsiRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有自發(fā)凋亡的增高。當(dāng)不同濃度的5-FU(13、130、1300、13000mg/L)處理細(xì)胞24h后，MTT結(jié)果表明Bcl-XLsiRNA細(xì)胞組A570吸光度值較陰性si

5、RNA細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染對照明顯降低，細(xì)胞生長抑制率明顯增高(21.78±1.58％vs4.01±2.26％or6.85±0.98％；36.26±1.15％vs19.99±1.00％or20.47±0.52％；42.21±0.45％vs25.75±1.10％or27.47±0.93％；68.28±1.11％vs60.71±1.72％or58.76±0.71％；P＜0.05)。當(dāng)不同濃度的DADS(20、35、50mg/L)孵育細(xì)胞24小時后

6、，MTT結(jié)果表明Bcl-XLsiRNA細(xì)胞組A570值較陰性siRNA細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染對照也有明顯降低，細(xì)胞生長抑制率有明顯增高(26.86±0.95％vs17.34±1.02％or15.33±1.56％；37.41±0.60％vs19.06±1.21％or18.46±0.85％；43.41±0.82％vs33.19±1.08％or32.27±1.10％；P＜0.05)。5-FU或DADS藥物的IC50值在Bcl-XLsiRNA細(xì)胞組有明

7、顯降低。使用5-FU(130mg/L)或DADS(50mg/L)處理細(xì)胞24小時后，流式結(jié)果表明，Bcl-XLsiRNA細(xì)胞組較陰性siRNA和正常對照細(xì)胞組亞G1細(xì)胞比例有明顯增高(5-FU：46.37±1.40％vs18.57±0.59％or21.10±1.90％，P＜0.05；DADS：58.07±1.05％vs25.43±0.50％or24.53±0.85％，P＜0.05)。 結(jié)論1.Bcl-XLsiRNA下調(diào)了MGC-