燒傷后增生性瘢痕相關(guān)基因P311功能的初步研究.pdf

1、本研究擬從如下三方面研究P311在增生性瘢痕形成中的可能作用：①P311基因及蛋白在增生性瘢痕組織中的分布，以了解何種細(xì)胞在瘢痕組織中高表達(dá)P311基因及蛋白，為下一步鎖定研究何種細(xì)胞奠定基礎(chǔ)；②向靶細(xì)胞導(dǎo)入P311基因，以觀察靶細(xì)胞在此基因作用下的功能變化和細(xì)胞周期變化；③干擾靶細(xì)胞P311基因的表達(dá)，以觀察靶細(xì)胞的功能變化。通過上述三方面的工作，以期闡明P311基因在增生性瘢痕形成和病理變化中的作用。 研究內(nèi)容:1.P311

2、基因及其蛋白在燒傷后不同時(shí)期增生性瘢痕組織中的定位分布表達(dá)(1)用原位雜交技術(shù)檢測燒傷后增生性瘢痕組織中P311mRNA定位分布表達(dá)。 (2)用免疫組化檢測P311蛋白在燒傷后增生性瘢痕組織中的定位表達(dá)。制備兔抗人P311抗體，然后用該抗體進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測P311蛋白在燒傷后增生性瘢痕組織中的定位表達(dá)。 (3)RT-PCR檢測P311mRNA在不同組織胚層來源細(xì)胞中的表達(dá)。原代分離培養(yǎng)人皮膚來源成纖維細(xì)胞、燒傷后增

3、生性瘢痕來源成纖維細(xì)胞、正常皮膚來源表皮細(xì)胞、正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞、正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；分別提取上述細(xì)胞的總RNA，然后用RT-PCR技術(shù)檢測P311mRNA在上述細(xì)胞中的表達(dá)。 2.上調(diào)表達(dá)P311基因后成纖維細(xì)胞的生物特性變化(1)構(gòu)建并鑒定表達(dá)人源P311基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體。 (2)利用腺病毒載體將人源P311基因?qū)胝Ｆつw及增生性瘢痕組織來源的成纖維細(xì)胞。 (3)利用FPCL模型(Fi

4、broblast-PopulatedCollagenLattice)，即成纖維細(xì)胞的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察的收縮能力變化。 (4)用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染P311基因前后成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA、TGF-β1、α1(Ⅰ)collagengene(COL1A1)mRNA的變化。 3.抑制P311基因表達(dá)后成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性變化(1)設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對人P311基因的siRNA質(zhì)粒HK、MB1、MB2、MB3。 (2)用F

5、uGene6轉(zhuǎn)染試劑將上述質(zhì)粒導(dǎo)入瘢痕來源成纖維細(xì)胞中，根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)觀察轉(zhuǎn)染效率，其后在G418壓力下篩選穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞克隆，并擴(kuò)增培養(yǎng)。RT-PCR及WesternBlot檢測RNA干擾效率，選擇干擾效率最佳的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 (3)利用FPCL模型觀察抑制P311基因表達(dá)后，瘢痕來源成纖維細(xì)胞的收縮能力變化。 (4)用RT-PCR檢測抑制P311基因前后瘢痕來源成纖維細(xì)胞表達(dá)TGF-β1的變化

6、。 結(jié)論:1.P311mRNA及蛋白表達(dá)于增生性瘢痕組織真皮層內(nèi)的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞漿中，而在皮膚表皮細(xì)胞、正常皮膚組織來源成纖維細(xì)胞、增生性瘢痕組織來源成纖維細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中不表達(dá)。這些細(xì)胞在真皮層內(nèi)聚集成團(tuán)，并被旋渦狀的、粗大紊亂的膠原纖維所包繞。這些細(xì)胞主要出現(xiàn)于燒傷后早期的增生性瘢痕組織中，隨著瘢痕的成熟、軟化，表達(dá)P311基因的成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯減少，最后消失。 2.成功制備了攜帶hP3

7、11基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒，為進(jìn)一步研究P311基因的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，。 3.成功制備了針對hP311基因的siRNA質(zhì)粒，為深入研究P311基因的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 4.從細(xì)胞表面標(biāo)志、細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、膠原蛋白類型變化以及細(xì)胞增殖變化、細(xì)胞生物學(xué)行為改變上看，轉(zhuǎn)染P311基因可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并可能在增生性瘢痕形成過程中發(fā)揮了一定的作用。 5.基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們提出如下假說

8、：P311蛋白可能通過PEST結(jié)構(gòu)域作用于泛素-蛋白酶體通路，抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)TGF-β信號(hào)通路中Smad蛋白的降解，導(dǎo)致Smad蛋白在細(xì)胞內(nèi)堆積，出現(xiàn)胞內(nèi)TGF-β信號(hào)的異常放大，從而可能使成纖維細(xì)胞對TGF-β等細(xì)胞因子的敏感性明顯增加，并可能使增生性瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞表型發(fā)生肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使其表達(dá)α-SMA、分泌TGF-β1、COL1A1增加，細(xì)胞分裂增殖增加，細(xì)胞收縮能力也明顯增強(qiáng)；同時(shí)，P311蛋白還通過促進(jìn)成纖維