增生性瘢痕中P物質(zhì)的效應(yīng)與機(jī)制研究.pdf

1、目的：增生性瘢痕(HyperplasticScar，HS)是人類皮膚受損后出現(xiàn)的一種病理現(xiàn)象，更是燒傷后康復(fù)的一大難題，其發(fā)病機(jī)制至今尚不十分清楚。有研究顯示神經(jīng)肽P物質(zhì)(SubstanceP，SP)與瘢痕增生瘙癢密切相關(guān)，但其作用效應(yīng)及機(jī)制不清，本實(shí)驗(yàn)從以下幾方面進(jìn)行研究：1.SP對(duì)HS成纖維細(xì)胞(fibroblast,FB)增殖、活力和膠原合成的影響和量效關(guān)系，對(duì)肥大細(xì)胞(mastcell，MC)組胺釋放的影響和量效關(guān)系；2.SP對(duì)

2、成纖維細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)基因的作用情況；3.β-catenin蛋白在HS組織中含量與細(xì)胞內(nèi)定位的情況，以推測(cè)其在瘢痕增生中的作用；4.SP是否可以對(duì)成纖維細(xì)胞的β-catenin表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用，探討SP促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的發(fā)生機(jī)制；5.應(yīng)用SP受體拮抗劑對(duì)SP的作用加以干預(yù)，研究拮抗劑對(duì)SP作用的阻斷效果，為研發(fā)抗瘢痕增生藥物打下基礎(chǔ)。 方法：收集HS及正常皮膚(normalskin，NS)組織，組織塊分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，分別

3、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.應(yīng)用免疫組化方法觀察SP神經(jīng)纖維在HS和NS組織中的形態(tài)，以及SP在HS和NS分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖和活力、3H-脯氨酸攝入測(cè)定SP對(duì)其膠原代謝的影響；觀察HS成纖維細(xì)胞經(jīng)過SP作用后電鏡的形態(tài)學(xué)改變。2.應(yīng)用不同時(shí)間和劑量的SP及不同濃度的Ca2+作用于人HS中肥大細(xì)胞，用免疫熒光法測(cè)定組胺的釋放率，免疫組化及甲苯胺藍(lán)研究HS中SP神經(jīng)纖維和肥大細(xì)胞的改變和形態(tài)關(guān)聯(lián)，光鏡及電鏡研

4、究HS中肥大細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變。3.免疫組化染色檢測(cè)HS及NS中增殖細(xì)胞核抗原PCNA、c-myc原癌基因、Bcl-2凋亡抑制基因及Bax凋亡促進(jìn)基因蛋白的表達(dá)情況；TUNEL法行細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)；分離培養(yǎng)細(xì)胞檢測(cè)SP及其受體拮抗劑對(duì)PCNA、c-myc、Bcl-2和Bax蛋白的作用以及細(xì)胞的凋亡情況。4.應(yīng)用免疫組化方法及原位雜交方法檢測(cè)HS及NS組織中β-catenin蛋白的表達(dá)情況及細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的定位。5.S

5、P及其受體拮抗劑作用于成纖維細(xì)胞后，檢測(cè)β-catenin基因及蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.在HS中，SP神經(jīng)纖維分布顯著高于NS。 2.SP可以促進(jìn)HS成纖維細(xì)胞增殖和活力，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的膠原合成，可引起HS成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變。 3.SP對(duì)HS作用條件從SP低濃度1×10-6M即可開始起作用。 4.HS中SP與MC密切關(guān)聯(lián)，呈“串珠”樣形態(tài)。與NS相比，HS中的SP和MC在數(shù)量、形態(tài)、相

6、互的作用及聯(lián)系等多個(gè)方面均存在顯著差異。 5.HS中SP對(duì)MC作用強(qiáng)于NS，MC脫顆粒組織胺釋放存在SP劑量和時(shí)間依賴性，并且SP對(duì)MC作用受鈣離子濃度影響。 6.PCNA、c-myc和Bcl-2在HS中的陽性細(xì)胞率顯著高于NS組織，而Bax在HS中的陽性細(xì)胞率顯著低于NS組織。 7.在HS組織中凋亡細(xì)胞率低于NS組織。 8.SP可以增強(qiáng)PCNA、bcl-2和c-myc基因表達(dá)，抑制bax基因，抑制細(xì)胞凋

7、亡，從而促進(jìn)瘢痕的增殖。此作用可被其受體拮抗劑阻斷。 9.在HS中β-catenin的蛋白水平和mRNA水平均顯著高于NS組織。 10.NS和HS中β-catenin在細(xì)胞中表達(dá)部位不同，NS中β-catenin多表達(dá)于胞膜上，而HS中出現(xiàn)顯著的β-catenin胞漿及胞核的異位聚集。 11.SP可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的β-catenin基因及蛋白表達(dá)上調(diào)。 12.SP誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞β-catenin表達(dá)作用

8、可基本被其受體拮抗劑阻斷。 結(jié)論： 1.SP有促成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的作用以及促肥大細(xì)胞組胺釋放的作用，參與HS的增殖過程和瘙癢癥狀的產(chǎn)生。 2.SP從低濃度1×10-6M即可促成纖維細(xì)胞增殖和肥大細(xì)胞組胺釋放。 3.PCNA、c-myc、Bcl-2和Bax參與了瘢痕增殖與凋亡的過程，并且瘢痕增生與其細(xì)胞凋亡受到抑制相關(guān)。 4.SP可以增強(qiáng)PCNA、bcl-2和c-myc表達(dá)，抑制bax表達(dá)，