基于生物網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下丹參抗腫瘤血管生成研究——隱丹參酮誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的重要過(guò)程。作為血管生成的基礎(chǔ)單元，血管內(nèi)皮細(xì)胞在多種促血管生成因子的作用下，會(huì)不斷增殖，促使腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)的不斷擴(kuò)張。目前，多種治療策略就是靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤血管生成過(guò)程中發(fā)揮作用。隱丹參酮是丹參脂溶性醌類(lèi)化合物之一。前期有關(guān)隱丹參酮抗腫瘤的整體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮具有顯著的抑制腫瘤血管生成的能力。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)被多個(gè)課題組所證實(shí)。然而，隱丹參酮的抗腫瘤血管的作用機(jī)制鮮有報(bào)道。鑒于此，本課

2、題選擇隱丹參酮來(lái)研究其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及其具體的作用機(jī)制。
　　本研究首先是采用血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成實(shí)驗(yàn)、大鼠動(dòng)脈環(huán)的血管生成實(shí)驗(yàn)和B16F10荷瘤小鼠的瘤內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞、離體和整體動(dòng)物三方面來(lái)考查隱丹參酮對(duì)腫瘤血管生成的影響。以隱丹參酮(Cryptotanshinone)為檢索詞，通過(guò)Cytoscape軟件篩選到隱丹參酮調(diào)控血管生成的可能靶點(diǎn)或通路，即主要與誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS超載的凋亡、抑制MAPK信號(hào)通路及Bcl-2

3、蛋白家族等有關(guān)。采用MTT法、流式細(xì)胞儀、Western blot考查隱丹參酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，結(jié)果表明隱丹參酮能劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，且主要與其誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡有關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡主要與其促進(jìn)線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素C的釋放，激活內(nèi)源性線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)通路有關(guān)。檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)隱丹參酮對(duì)細(xì)胞色素C釋放的影響，發(fā)現(xiàn)隱丹參酮作用6h后，就能在胞漿中檢測(cè)到細(xì)胞色素C。使用線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)

4、運(yùn)孔的特異性抑制劑—環(huán)孢菌素A，發(fā)現(xiàn)在同樣時(shí)間點(diǎn)即6h時(shí)，仍能檢測(cè)到細(xì)胞色素C的釋放。表明隱丹參酮作用6h時(shí)引起的細(xì)胞色素C的釋放并不是由線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放引起的;通過(guò)檢測(cè)線(xiàn)粒體外膜機(jī)械性損傷相關(guān)指標(biāo)Ca2+濃度和ROS的水平發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮作用6h時(shí)并不會(huì)引起細(xì)胞中Ca2+濃度和ROS水平的超載和線(xiàn)粒體的超微結(jié)構(gòu)的損傷，即進(jìn)一步排除了隱丹參酮通過(guò)引發(fā)線(xiàn)粒體外膜機(jī)械性損傷誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放;Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隱丹參

5、酮作用6h時(shí)能顯著抑制Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，升高Bax和BimEL的表達(dá)。其中，BimEL的變化最為明顯;采用siRNA沉默Bim表達(dá)發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放受到了一定程度的影響;Bim的沉默并不影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性和管腔形成能力，初步表明隱丹參酮作用6h引起的細(xì)胞色素C的釋放與線(xiàn)粒體外膜上特異性通道的形成有關(guān)，且主要與促凋亡蛋白Bim有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中BimEL與Bax蛋白相互

6、結(jié)合形成復(fù)合物，再同線(xiàn)粒體外膜VDAC結(jié)合，進(jìn)而來(lái)調(diào)控細(xì)胞色素C的釋放。
　　以上結(jié)果表明，隱丹參酮促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中BimEL與Bax蛋白相互結(jié)合形成復(fù)合物，再同線(xiàn)粒體外膜VDAC結(jié)合，調(diào)控線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素C釋放到胞漿，進(jìn)而激活內(nèi)源性線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)通路，最終誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用。
　　在正常成年人的血管中，絕大部分血管內(nèi)皮細(xì)胞都處于靜息期。那么，隱丹參酮是否對(duì)靜息期的血管內(nèi)皮細(xì)胞有作用？為排除這一