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文檔簡介
1、[背景和目的]
中藥研究的一個(gè)重點(diǎn)和難點(diǎn)問題就是理解中藥方劑復(fù)雜化學(xué)體系與病證發(fā)展生物系統(tǒng)的相互作用,闡明中藥方劑微因多效的分子機(jī)制。近些年從分子細(xì)胞水平探討中藥方劑多成分多靶點(diǎn)的作用也已經(jīng)取得令人可喜的成績,為中藥方劑的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?;钛龇ㄊ侵嗅t(yī)治療腫瘤的大法,丹參作為活血化瘀藥的代表,在臨床主要用于心血管疾病的治療,另外在抗腫瘤治療中也是常用的中藥之一,治療肝癌的復(fù)方中幾乎都含有丹參。臨床上應(yīng)用的多是丹參水提物
2、或者注射液,基于“單成分應(yīng)用于多種疾病的”理論,在丹參水溶性成分中其物質(zhì)作用基礎(chǔ)是什么?是否通過影響兩種疾病的共同因素發(fā)揮作用?
實(shí)驗(yàn)室前期通過數(shù)據(jù)挖掘工具分析探究丹參有效成分抗腫瘤的相關(guān)靶點(diǎn),發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ1型受體AT1R(AngiotensinⅡtype1 receptor)在心血管疾病和腫瘤生長、轉(zhuǎn)移特別是腫瘤血管生成中都有重要的作用。因此,我們期望探究丹參水溶性成分是否通過影響腫瘤細(xì)胞AT1R干擾腫瘤血管生成,以進(jìn)一
3、步闡明丹參多成分多靶點(diǎn)治療疾病的分子機(jī)制。
[實(shí)驗(yàn)內(nèi)容]
本文以惡性程度高、血管依賴性強(qiáng)的肝癌為病理模型剖析丹參水溶性成分是否通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞AT1R蛋白的表達(dá)影響肝癌血管生成。第一章考察了臨床肝癌樣本中AT1R與血管生成指標(biāo)VEGF、MVD(微血管密度)的相關(guān)性。第二章從丹參水溶性成分中篩選能夠影響AngⅡ-AT1R軸的有效成分,利用小鼠海綿植入血管生成模型篩選了丹參4種水溶性成分,分別通過檢測海綿中血紅蛋白含量、
4、小鼠血清中VEGFA的濃度、HE染色血管計(jì)數(shù)及免疫組化計(jì)數(shù)初步篩選出有效成分。接著通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證篩選出的成分的作用和機(jī)制。第三章考察有效成分在肝癌血管生成中的作用,利用Western bloting和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)篩選AT1R高表達(dá)的細(xì)胞株,MTS法考察有效成分對AngⅡ誘導(dǎo)下肝癌細(xì)胞增殖的影響,利用WB和ELISA法檢測有效成分對AngⅡ誘導(dǎo)下肝癌細(xì)胞AT1R蛋白表達(dá)及細(xì)胞上清中VEGFA濃度的影響,最后考察有效成分對肝癌
5、裸鼠移植瘤瘤體積和血管生成的影響。
[研究結(jié)果]
第一章通過免疫組化檢測40例肝癌樣本,發(fā)現(xiàn)肝癌組織中AT1R的表達(dá)與VEGF的表達(dá)、MVD均呈正相關(guān),表明在肝癌血管生成中AT1R是一個(gè)重要的因素。第二章通過海綿植入模型的篩選及海綿中血紅蛋白、小鼠血清VEGFA的濃度檢測、海綿切片血管計(jì)數(shù)等方法,我們發(fā)現(xiàn)在4種水溶性成分中丹酚酸B2mg/Kg能夠有效地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管生成,免疫組化結(jié)果顯示丹酚酸B能夠下調(diào)血管內(nèi)
6、皮AT1R蛋白的表達(dá)及VEGFA的產(chǎn)生。為進(jìn)一步證實(shí)丹酚酸B的作用,結(jié)果表明丹酚酸B對AngⅡ誘導(dǎo)的原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖沒有顯著影響,但能夠有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC的遷移和管腔形成。WB實(shí)驗(yàn)表明,丹酚酸B能夠劑量依賴性地下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC中AT1R蛋白表達(dá),ELISA實(shí)驗(yàn)表明,丹酚酸B能夠劑量依賴性的減少細(xì)胞上清中VEGFA的濃度。利用斑馬魚血管生成模型進(jìn)一步證實(shí)丹酚酸B的整體作用,實(shí)驗(yàn)表明丹酚酸B能
7、夠有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的斑馬魚血管生成。第三章首先通過篩選肝癌細(xì)胞中AT1R高表達(dá)的細(xì)胞株,確定了表達(dá)程度最高的2株:SMMC7721和HepG2,丹酚酸B對2株肝癌細(xì)胞的增殖及AngⅡ刺激下的增殖均無顯著的影響,但能夠劑量依賴性的下調(diào)肝癌細(xì)胞AT1R的表達(dá)及細(xì)胞上清中VEGFA的含量,最后通過SMMC7721裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹酚酸B能夠有效的抑制肝癌移植瘤的生長,但體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對肝癌細(xì)胞的增殖沒有顯著的影響,那么是否是通過影響血管
8、生成的結(jié)果昵?通過免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹酚酸B能夠劑量依賴性的下調(diào)移植瘤中AT1R蛋白的表達(dá)及VEGFA的表達(dá),同時(shí)減少肝癌組織中CD34的表達(dá)。
[結(jié)論和意義]
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丹參水溶性成分中丹酚酸B通過下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中AT1R蛋白的表達(dá),減少血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的自分泌,從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成。在肝癌中,丹酚酸B通過下調(diào)肝癌細(xì)胞的AT1R的表達(dá),減少肝癌細(xì)胞的VEGF的分泌,從而影響VEGF以
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