耶爾森氏菌蛋白在促甲狀腺素受體自身抗體產(chǎn)生中分子模擬機(jī)制的研究.pdf

1、甲狀腺是人體的重要內(nèi)分泌器官，它分泌的多種激素參與人體糖、脂和蛋白質(zhì)以及鈣等物質(zhì)的代謝調(diào)控，特別是甲狀腺激素，是維持人體正常代謝的核心激素之一。由于這些激素功能的重要性，因此它們的產(chǎn)生和活性都有高度受控的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制來保持其正常。這些機(jī)制主要包括：下丘腦產(chǎn)生甲狀腺釋放激素(TRH)從而刺激垂體產(chǎn)生甲狀腺刺激激素(TSH)，TSH再與甲狀腺濾泡細(xì)胞上的甲狀腺刺激激素受體(TSHR)結(jié)合，從而刺激甲狀腺激素的產(chǎn)生，這是一種正反饋機(jī)制；另外是

2、一種負(fù)反饋機(jī)制，即甲狀腺產(chǎn)生的游離甲狀腺激素T3能夠通過血液循環(huán)作用于下丘腦和垂體，從而反饋抑制TRH和TSH產(chǎn)生的。通過這兩種機(jī)制來調(diào)控甲狀腺激素維持在正常水平，既不太多，也不太少，從而發(fā)揮正常的調(diào)控作用。有很多原因能夠引起自身免疫功能的異常，從而破壞這一精細(xì)的調(diào)控機(jī)制而導(dǎo)致甲狀腺激素過多或過少，最終產(chǎn)生甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)或甲狀腺機(jī)能減退。由自身免疫原因引起的甲狀腺疾病即稱為自身免疫性甲狀腺疾病，它們的共同特征是存在針對(duì)多種甲狀腺抗原的自

3、身抗體，如TG、TPO和TSHR，而這些蛋白是甲狀腺激素產(chǎn)生過程中的關(guān)鍵蛋白。
　　 Graves′disease(GD)是一種常見的器官特異性自身免疫疾病，與橋本氏甲狀腺炎(HT)和特發(fā)性粘液性水腫(PM)一樣都是自身免疫性甲狀腺病(AITD)的主要類型，發(fā)病率在0.3‰左右，尤以年輕女性多發(fā)。AITD都存在不同程度甲狀腺組織的淋巴細(xì)胞浸潤；在病人的血清中都存在甲狀腺組織特異的自身抗體，主要包括抗甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、

4、抗甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)和抗促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)三種，就某種特定疾病而論，超過90％的Graves病(GD)病人存在抗TSHR的自身抗體，接近80％的Graves病(GD)病人存在抗TPO的自身抗體；而超過90％的HT病人有anti-TPO和/或anti-TG的自身抗體。但與anti-TSHR抗體不同，anti-TPO和anti-TG抗體在HT或GD的發(fā)病機(jī)制中并沒有重要意義，但它們能夠幫助人們進(jìn)行鑒別診斷和判斷

5、預(yù)后。而TRAb在GD、PM和部分HT患者血清中的陽性檢出率可高達(dá)80％～100％，被認(rèn)為是導(dǎo)致AITD，特別是GD發(fā)病的主要病因和自身抗原，是GD最重要的標(biāo)志物。作為一種典型的自身免疫性疾病，GD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，特別是TSHR的免疫耐受如何被破壞從而產(chǎn)生TRAb這一過程的確切機(jī)制目前仍不明確?，F(xiàn)在人們普遍認(rèn)為遺傳因素(HLA-DR，MHC，CTLA-4和PTPN22等)在這一過程中發(fā)揮重要作用；但很多證據(jù)也表明遺傳因素并非是導(dǎo)致自體免疫

6、耐受被破壞而產(chǎn)生抗TSHR抗體從而導(dǎo)致GD發(fā)生的唯一原因，感染、輻射、飲食和精神等眾多環(huán)境因素在機(jī)體對(duì)甲狀腺組織免疫耐受異常、產(chǎn)生TRAb等自身抗體而發(fā)病的過程中也發(fā)揮重要作用。但這些因素通過何種機(jī)制，如何導(dǎo)致免疫系統(tǒng)攻擊原本免疫耐受的自體組織器官而導(dǎo)致發(fā)病的具體環(huán)節(jié)目前仍不清楚。在這些環(huán)境因素中，感染是眾多自身免疫疾病的重要病因，目前認(rèn)為其破壞免疫耐受的重要機(jī)制之一就是因細(xì)菌、病毒等外來抗原與某些自身組織存在交叉免疫原性，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生

7、的針對(duì)外來抗原的抗體就會(huì)通過分子模擬機(jī)制而使原本免疫耐受的自身組織遭到免疫系統(tǒng)攻擊。此外還有細(xì)菌超抗原活化多克隆T細(xì)胞；甲狀腺等組織內(nèi)HLA分子表達(dá)增強(qiáng)等破壞自身免疫耐受的機(jī)制。
　　 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica，YE)是一種常見的感染因素，有腹瀉、心肌炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和結(jié)節(jié)性紅斑等腸道內(nèi)外癥狀。70年代人們發(fā)現(xiàn)GD患者中YE抗體(YEAb)的陽性率與正常對(duì)照和非GD組相比明顯增高，YE

8、菌體蛋白有穩(wěn)定的TSH結(jié)合位點(diǎn)，而且能夠被GD病人免疫球蛋白所識(shí)別和結(jié)合。我們之前對(duì)403例GD患者的研究也發(fā)現(xiàn)63％的GD患者伴YE引發(fā)的腹瀉，應(yīng)用YE敏感的抗生素治療后，70％的GD患者腹瀉緩解，同時(shí)GD病情和復(fù)發(fā)率也明顯降低，這些證據(jù)都提示YE與GD關(guān)系密切。之前已有研究認(rèn)為YE的包膜蛋白和脂蛋白與TSHR存在交叉免疫原性，但未能指出是那一種具體的蛋白以及蛋白上被TRAb所識(shí)別的具體的抗原表位。盡管與YE感染在GD發(fā)病中作用有關(guān)的

9、研究已進(jìn)行了35年，但目前仍未有定論，很多問題仍未能闡明：如YE中有那些蛋白與GD有關(guān)；這些蛋白及其不同抗原表位所對(duì)應(yīng)的抗體是否影響甲狀腺功能，它們單獨(dú)或與TSHR抗原表位聯(lián)合免疫動(dòng)物后能否導(dǎo)致甲狀腺功能異常等。因此更多揭示YE中能夠被TRAb識(shí)別且其抗體具有功能意義的蛋白、該蛋白上功能相關(guān)的抗原表位和其可能的致GD作用，以及它們與其它TSHR抗原表位的關(guān)系將有助于人們對(duì)YE與GD關(guān)系和GD發(fā)病機(jī)制的深入理解，也有助于對(duì)GD的診斷及預(yù)后

10、判定、免疫干預(yù)治療；而且，對(duì)人們深入理解免疫耐受形成和破壞的機(jī)制、感染在糖尿病等其它與自體免疫密切相關(guān)的疾病中的作用，也具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 技術(shù)的進(jìn)步使我們除了噬菌體展示肽庫，肽探針掃描和x-ray/MRI技術(shù)等經(jīng)典表位作圖技術(shù)外，還能夠利用免疫蛋白組學(xué)的技術(shù)，更加方便和高效的確定YE中完全未知的TRAb抗原蛋白，并確定功能相關(guān)的抗原表位。在這些技術(shù)的幫助下，我們利用GD患者的血清以及多種抗原表位位于TSHR的ECD內(nèi)的

11、商業(yè)化單克隆抗體與YE總蛋白進(jìn)行Western blot，發(fā)現(xiàn)在不同病人之間存在共同的陽性條帶，將該條帶剪切下來，經(jīng)膜上酶解和質(zhì)譜鑒定后，發(fā)現(xiàn)該條帶是YE蛋白中理論分子量為42KD的外膜孔蛋白F(ompF)。在這一研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了它的表達(dá)載體，研究結(jié)果表明表達(dá)純化后的ompF蛋白不僅仍能與原單抗結(jié)合，也能被經(jīng)GD病人的抗血清所識(shí)別，這進(jìn)一步確證了我們之前的研究結(jié)果。我們進(jìn)一步利用蛋白抗原性分析的相應(yīng)生物信息學(xué)工具，并在已知同

12、源蛋白空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過蛋白空間結(jié)構(gòu)同源建模工具得到了TSHR和ompF蛋白的空間結(jié)構(gòu)，利用這些數(shù)據(jù)，我們經(jīng)過綜合分析發(fā)現(xiàn)ompF上至少存在5個(gè)潛在抗原表位，而且這些表位都在蛋白結(jié)構(gòu)的表面，其中ompF上能夠被anti-hTSHRantibody所識(shí)別的抗原表位是位于190到197位間的氨基酸序列(DALGNVTS)。為了進(jìn)一步檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)的ompF蛋白上這些與TSHR可能存在交叉免疫反應(yīng)的抗原表位的功能意義，我們又進(jìn)一步制備了om

13、pF相應(yīng)抗原表位的多克隆抗體，發(fā)現(xiàn)該多克隆抗體能夠使人原代甲狀腺濾泡細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)人TSHR的CHO細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)cAMP升高，具有一定的TSAb活性。然而，YE在GD發(fā)病中的作用是一個(gè)十分復(fù)雜的問題，仍需要在很多領(lǐng)域進(jìn)行大量細(xì)致深入的研究，本研究的結(jié)果為進(jìn)一步的深入研究提供了線索。以此為基礎(chǔ)，我們可以利用基于親和純化和質(zhì)譜技術(shù)的epitope extraction和epitope excision技術(shù)對(duì)于ompF蛋白中能被anti-hT

14、SHR抗體所識(shí)別的抗原表位以及不同抗原表位所產(chǎn)生的抗體的功能意義進(jìn)行更加精確和詳盡的研究。另外，ompF、lipoproteins，envelope proteins andYOP等已發(fā)現(xiàn)的與TSHR具有交叉免疫原性的YE蛋白在GD發(fā)病和誘導(dǎo)TRAb產(chǎn)生中的確切作用和相互關(guān)系也需要進(jìn)一步的深入研究。只有在這些深入分子水平的研究的基礎(chǔ)上，才能明確YE在TRAb產(chǎn)生和GD發(fā)生和發(fā)展中的作用，對(duì)GD的診斷、預(yù)后及免疫干預(yù)治療都具有重要的意義，