鼠疫耶爾森氏菌在小鼠巨噬細(xì)胞上的受體——Murine SIGN-R1.pdf

1、目的：鼠疫耶爾森氏菌是一類引起人與動物鼠疫的革蘭氏陰性菌，其自然宿主是嚙齒類動物。它能夠利用抗原呈遞細(xì)胞(抗原presentingcells，APCs)的捕獲，轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)，引起淋巴結(jié)鼠疫。但是APCs最初如何捕捉鼠疫菌仍然未知。由于近來發(fā)現(xiàn)的C型凝集素受體與某些革蘭氏陰性菌的核心脂多糖(核心LPS)有作用。因此，我們推測鼠疫菌也是通過某種C型凝集素進(jìn)入到APCs的，例如巨噬細(xì)胞。本次實驗將對這個機制加以驗證，并找到相應(yīng)的配體和受體。

2、 方法：1通過轉(zhuǎn)染，建立穩(wěn)定表達(dá)小鼠C型凝集素受體的細(xì)胞株。含有5種C型凝集素受體cDNA保存在表達(dá)載體pcDNA3.1中，轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞株，得到CHO-mDC-SIGN、CHO-mSIGN-R1、CHO-mSIGN-R3、CHO-mDEC-205(CD205)和CHO-mLangerin(CD207)轉(zhuǎn)染株，經(jīng)過長時間G418篩選，找到能穩(wěn)定表達(dá)的單克隆株，并用流式細(xì)胞儀檢測。 2構(gòu)建鼠疫菌的光滑型和深度粗糙型。野生鼠

3、疫菌是粗糙型，核心脂多糖暴露在最外面。用自殺質(zhì)粒同源重組的方法缺失編碼核心脂多糖起始位的糖基轉(zhuǎn)移酶，將阻斷核心脂多糖的表達(dá)，得到鼠疫菌深度粗糙型。在核心脂多糖外側(cè)表達(dá)O-抗原將得到光滑型。 3.粘附和侵襲實驗細(xì)胞懸浮于含2％FBS的RPMI，以4×105/ml鋪在96或24孔平板中。按照1:50體積加入濃度為1×107CFU/ml的細(xì)菌。在37℃，5％CO2下孵育2.5小時。細(xì)胞經(jīng)過洗滌后用0.5％的saponin裂解，將裂解液

4、稀釋后涂在平板上，得到粘附和侵襲細(xì)菌的總量。 用慶大霉素處理細(xì)菌和細(xì)胞混合液，能夠殺死細(xì)胞外的細(xì)菌而不透過宿主細(xì)胞膜，得到的是侵入細(xì)菌的數(shù)量。100ug/ml的慶大霉素作用1小時后洗去抗生素，裂解細(xì)胞進(jìn)行涂菌計數(shù)。細(xì)菌侵襲的程度以細(xì)胞裂解液中細(xì)菌的CFU來估算。所有的實驗重復(fù)3次。 4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)菌的侵襲能力。細(xì)菌在熒光試劑CFDA-SE中染色，洗去多余的染色液后，把標(biāo)定好的細(xì)菌加入到細(xì)胞中培養(yǎng)2小時。細(xì)胞液經(jīng)過洗

5、滌除去未結(jié)合的細(xì)菌后，用2％的多聚甲醛固定。在做流式細(xì)胞儀檢測前，以1:10加入Trypan blue(0.4％)混勻，室溫10分鐘以淬滅細(xì)胞外細(xì)菌的熒光。Trypan blue能阻止熒光但不能透過細(xì)胞膜。被攝取細(xì)菌的比例以細(xì)胞發(fā)出的熒光強度來判定，強度越高，細(xì)菌被吞噬的程度越高。 5 外源物質(zhì)抑制實驗加入外源物質(zhì)包括抗體，甘露糖，低聚糖，肽等來封阻細(xì)胞的吞噬作用，驗證細(xì)菌和細(xì)胞相互作用的特異性。 6 體內(nèi)吞噬實驗向活體