鼠疫耶爾森氏菌降解其分泌的鼠毒素研究.pdf

1、鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌（以下簡稱鼠疫菌）引起的一種自然疫源性烈性傳染病，歷史上曾發(fā)生過三次人間鼠疫大流行引起數(shù)以億計的人死亡，給人類帶來巨大的災難。鼠疫在我國被規(guī)定為甲類傳染病，我國鼠疫自然疫源地分布廣泛，占國土面積的15％左右，且疫區(qū)動物鼠疫流行面積不斷擴大，人間鼠疫病例呈上升態(tài)勢。此外，鼠疫菌又是一種生物戰(zhàn)劑和恐怖劑，威脅著人類的安全。因此鼠疫的防治對人民健康安全、經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定依然具有重要意義。
　　毒力完整的鼠疫菌含有

2、三個毒力質(zhì)粒（pCD1、pMT1、pPCP1），其中pCD1質(zhì)粒被認為是鼠疫菌增殖擴散發(fā)揮毒力作用最主要的毒力質(zhì)粒，其編碼的T3SS將Yops蛋白“注射”到宿主細胞中，通過干擾細胞的正常生理功能、抑制免疫反應導致宿主死亡。pMT1質(zhì)粒主要編碼了鼠毒素，是鼠疫菌在跳蚤中腸生存形成菌栓的重要因素，在鼠疫菌傳播中發(fā)揮重要作用。pPCP1質(zhì)粒主要編碼pla基因，Pla蛋白具有蛋白水解酶活性，并且可以降解Yops蛋白，是導致鼠疫菌高侵襲性的重要因

3、素。故pMT1、pPCP1質(zhì)粒在鼠疫菌傳播和擴散的過程中也起到了非常重要的作用。在前期工作中，我們使用一株自內(nèi)蒙古分離的布氏田鼠（Microtus brandii）型鼠疫菌201株，它含有pPCP1質(zhì)粒、pCD1質(zhì)粒、pMT1質(zhì)粒和pCRY質(zhì)粒。本室倪斌博士以鼠疫菌201株為母本，采用質(zhì)粒無痕消除的策略，對4個質(zhì)粒進行了不同程度的消除，獲得了不同質(zhì)粒缺失的突變株（201-pPCP1+pCD1+pMT1+、201-pPCP1+pMT1+、

4、201-pPCP1+pCD1+、201-pCD1+pMT1+、201-pCD1+、201-pPCP1+、201-pMT1+、201-p）。
　　通過各質(zhì)粒缺失株小鼠攻毒實驗，我們發(fā)現(xiàn)高劑量下只含有pMT1質(zhì)粒的菌株（201-pMT1+）對小鼠表現(xiàn)出異常的毒力，這與pMT1質(zhì)粒不含重要的毒力因子的結(jié)論不吻合。通過對各質(zhì)粒缺失株進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示所有含pMT1質(zhì)粒的菌株（201-pPCP1+pCD1+pMT1+、2

5、01-pPCP1+pMT1+、201-pCD1+pMT1+、201-pMT1+）菌體中均有Ymt條帶，其中含pMT1質(zhì)粒且含pPCP1質(zhì)粒的菌株（201-pPCP1+pCD1+pMT1+、201-pPCP1+pMT1+）的培養(yǎng)上清中檢測不到Y(jié)mt條帶，但可以檢測到Y(jié)mt的降解片段；含pMT1質(zhì)粒且不含pPCP1質(zhì)粒的菌株（201-pCD1+pMT1+、201-pMT1+）的培養(yǎng)上清中可以檢測到Y(jié)mt條帶。一直以來Ymt被公認為是一種胞內(nèi)

6、蛋白，本實驗首次在pPCP1質(zhì)粒缺失株的分泌上清中檢測到它，提示鼠疫菌分泌的Ymt可能在分泌過程中被pPCP1質(zhì)粒所降解。
　　為了進一步探究Ymt蛋白是否是在分泌過程中被降解？被哪些基因降解？是否是直接降解？我們利用Red重組系統(tǒng)，采用一步法基因突變技術(shù)，構(gòu)建了pla敲除株（201- pCD1+-pMT1+-pPCP1+-Δpla、201-pMT1+-pPCP1+-Δpla）；利用可以在鼠疫菌內(nèi)復制，并且拷貝數(shù)與鼠疫菌質(zhì)粒相近的

7、pACYC184質(zhì)粒，構(gòu)建了pla回補株（201-pCD1+-pMT1+-pPCP1+-Δpla-pACYC184-pla、201-pMT1+-pPCP1+-Δpla-pACYC184-pla），基于構(gòu)建成功的pla敲除株和pla回補株，將二者的分泌上清進行了SDS-PAGE電泳和WB驗證，結(jié)果均顯示敲除了pla的鼠疫菌（201- pCD1+-pMT1+-pPCP1+-Δpla、201-pMT1+-pPCP1+-Δpla）的分泌上清中可

8、以檢測到Y(jié)mt蛋白，而pla回補株（201-pCD1+-pMT1+-pPCP1+-Δpla-pACYC184-pla、201-pMT1+-pPCP1+-Δpla-pACYC184-pla）的分泌上清中檢測不到Y(jié)mt蛋白，但可以檢測到Y(jié)mt蛋白的降解片段，證明pPCP1質(zhì)粒編碼的pla降解了Ymt蛋白。為了進一步驗證我們的發(fā)現(xiàn)，體外構(gòu)建了BL21-pET28a-pla、BL21-pET28a-ymt獲得體外表達純化的Pla蛋白和Ymt蛋白

9、，并對純化后的Pla蛋白和Ymt蛋白進行了生物活性測定，證明二者均有活性。其中，重點測定了Ymt蛋白對小鼠的毒性，首次觀察了純化Ymt蛋白對小鼠臟器的病理學損傷。將純化后的Pla蛋白和Ymt蛋白在離體37℃條件下孵育，孵育后的混合蛋白液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示混合蛋白液中只有Ymt蛋白沒有Ymt蛋白的降解片段，故純化后的Pla不能降解Ymt蛋白。我們將重組質(zhì)粒pACYC184-pla導入到只含有染色體基因而不含質(zhì)粒的鼠疫菌中構(gòu)

10、建重組菌株（P?-pACYC184-pla），將重組菌株（P?-pACYC184-pla）與純化的Ymt蛋白37℃孵育，上清進行SDS-PAGE電泳。構(gòu)建重組菌株（E.coli K12-pACYC184-pla、E.coli K12-pET28a-pla），重組后的菌株實驗同上。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示兩株重組菌株與Ymt蛋白孵育后的上清中無Ymt條帶，檢測到Y(jié)mt降解片段，進一步證明在沒有其他鼠疫菌質(zhì)粒存在的情況下、無鼠疫菌菌體內(nèi)

11、參與的情況下，Pla蛋白可以降解Ymt蛋白。
　　本研究首次證明Ymt蛋白是分泌蛋白，并且Ymt蛋白在分泌過程中可以被pPCP1質(zhì)粒編碼的pla所降解。研究過程中沒有檢測到純化后的Pla蛋白降解Ymt蛋白，我們推測可能是由于Pla降解Ymt還需要借助于其他因子，也可能是Pla蛋白需要特殊的空間結(jié)構(gòu)才發(fā)揮作用，或者Pla降解Ymt蛋白存在一種特殊的機制。本研究結(jié)果為深入揭示鼠疫菌致病機制奠定了基礎(chǔ)，也為鼠疫菌毒力進化的研究提供有力證